SDS-聚丙烯胺凝胶的制备方法
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(一)
试剂
1. 30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29 g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺 1 g
蒸馏
水 100 ml
加热至50℃搅拌溶解,于4℃保存。
2.10%SDS:
蒸馏
水配制,室温保存。
3.10%过硫酸铵:蒸馏水配制,4℃保存,一周内使用。
4.TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
5.1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)
6.电泳缓冲液
25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
250 mmol/L 甘氨酸
0.1% SDS
7.电泳加样缓冲液
50 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)
50 mmol/L 二硫苏糖醇(
DTT
)
2 % SDS
1 % 溴酚蓝
10 % 甘油
(二)操作
1.将玻璃板和垫片依次用5%的KOH甲醇溶液、去污剂和清水洗涤,晾干。将无凹口的玻璃板平放在桌面上;将垫片两面涂少许凡士林后,排放在玻璃两侧,再将有凹口的玻璃板在垫片上放置妥当。将玻璃夹层推至桌沿,用胶带纸封闭三个侧面,留出有凹口的一面不封闭。
2.使玻璃夹层竖立,有凹口面朝上。根据所需的凝胶浓度和用量,按表7-1的比例配制分离胶溶液
3.一旦加入TEMED,混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,为积层胶留有足够空间。用吸管轻轻在其顶层加入几毫升异丁醇,以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。
4.聚合完成后(约30~60分钟)后,倒掉覆盖液体,用蒸馏水洗凝胶上部数次,尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残余液体
5.根据所需用量,按表7-2的比例配制积层胶溶液。
6.注入积层胶溶液,插入梳子,小心避免气泡,垂直放置于室温下。
7.在积层胶聚合完成(约30分钟)后,小心拔掉梳子。用蒸馏水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺。
8.将凝胶放入电泳槽中,上下槽均加入1×电泳缓冲液,检查是否泄漏。驱除两玻璃板之间凝胶底部的气泡,即可上样。
表7-1 配制SDS-PAGE凝胶电泳分离胶浓度与所用溶液量
溶液成分 |
5~50ml凝胶溶液中各成分所需体积(ml) |
||||||
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
40 |
50 |
|
12% 凝胶溶液 H 2 0 30%丙烯酰胺 1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8) 10%SDS 10%过硫酸胺 TEMED
15% 凝胶溶液 H 2 0 30%丙烯酰胺 1.5mol/L Tris -HCl (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED |
3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004
2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 |
4.9 6.0 3.8 0.15 0.15 0.006
3.4 7.5 3.8 0.15 0.15 0.006 |
6.6 8.0 5.0 0.2 0.2 0.008
4.6 10.0 5.0 0.2 0.2 0.008 |
8.2 10.0 6.3 0.25 0.25 0.010
5.7 12.5 6.3 0.25 0.25 0.010 |
9.9 12.0 7.5 0.3 0.3 0.012
6.9 15.0 7.5 0.3 0.3 0.012 |
13.2 16.0 10.0 0.4 0.4 0.016
9.2 20.0 10.0 0.4 0.4 0.016 |
16.5 20.0 12.5 0.5 0.5 0.020
11.5 25.0 12.5 0.5 0.5 0.020 |
表7-2 配制 SDS -PAGE凝胶电泳积层胶所用溶液量
溶液成分 |
1~10ml凝胶溶液中各成分所需体积(ml) |
||||||
1 |
2 |
4 |
5 |
6 |
8 |
10 |
|
H 2 0 30%丙烯酰胺 1.0mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10%SDS 10%过硫酸胺 TEMED |
0.68 0.17 0.13 0.01 0.01 0.001 |
1.4 0.33 0.25 0.02 0.02 0.002 |
2.7 0.67 0.5 0.04 0.04 0.004 |
3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.005 |
4.1 1.0 0.75 0.06 0.06 0.006 |
5.5 1.3 1.0 0.08 0.08 0.008 |
6.8 1.7 1.25 0.1 0.1 0.010 |