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用SDS―聚丙烯酰凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

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SDS 是一种阴离子表面激活剂,在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原; SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质 -SDS 复合物。在一定条件下,SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g 蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质的 SDS- 复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS 与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质 -SDS 复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样,约为 1.8nm ,而长轴则随蛋白质的 M r 成正比的变化。基于上述原因,蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只与椭圆棒的长度有关, 也就是蛋白质 M r 的函数。
二、设备
1.垂直板电泳槽一套 2.直流稳压电源(500伏、100毫安)
3.抽气装置 4.10毫升注射器、100微量注射器各一支。
三、 试剂
1.丙烯酰胺(Acr)贮液:30克Acr, 0.8克甲叉双丙酰胺(Bis)。加水溶解定容至100毫升,过滤后使用,4℃下可贮藏1-2个月。
2.10%的SDS溶液。
3.10%的过硫酸铵溶液。
4.四甲基乙二胺(TEMED)。
5.分离胶缓冲液:1.0M pH8.8Tris-盐酸缓冲液,将12.1克用水溶解后,用6M盐酸调至pH8.8,用水定容至100毫升。
6.浓缩胶缓冲液,1.0M pH6.8Tris-盐酸缓冲液,将12.1克Tris用水溶解后用6M盐酸调至pH6.8,用水定容至100毫升。
7.电极缓冲液:将30.3克Tris 28.8克甘氨酸和2克SDS用水溶解后定容至200毫升,pH应为8.3,用时稀释10倍。
8.2X样品缓冲液,将2克SDS,5毫升β-巯基乙醇,10毫升甘油,2.0毫升0.1%溴酚蓝和2毫升 试剂 (6)混合,用水溶解并稀释到50毫升。样品为固体则稀释1倍使用,若为液体,则等量混合。
9.0.1%溴酚蓝溶液。
10.已知分子量的标准蛋白(M﹤10 万)4-6种。
11.未知分子量的蛋白质样品。
12.考马斯亮蓝溶液:称取0.25克考马斯亮蓝R-250,加入45毫升甲醇,10毫升冰醋酸和45毫升水,过滤后使用。
13.脱色液:37.5毫升冰醋酸。25毫升甲醇,加水至500毫升。
14.SDS的重结晶:50克SDS加100毫升无水乙醇,70℃下保温溶解。趁热过滤后,于低温下过夜结晶,过滤,用少量无水乙醇或乙醚洗涤二次,于真空干燥器内干燥。
四、操作程序
1.电泳槽板的安装(略)
2.制胶

按上表比例配制分离胶,本实验分离胶浓度为12%。混匀后将胶液沿玻璃板壁缓缓地注入已准备好的凝胶模子中,注胶过程防止气泡产生,胶液加到玻璃板顶部3厘米处,立即用注射器覆盖3-5毫米厚的水层,垂直静置聚合。
按上表比例配制浓缩胶,立即将胶液注入胶模内,插好样品梳。样品梳的下端应距分离胶1厘米,浓缩胶高约3厘米,聚合后,小心地取出样品梳。
3.样品处理及上样
准确吸取蛋白质样品0.5毫升,加入0.5毫升的样品缓冲液,在45℃ 水浴 中保温1 小时,或在沸水中加热2-3 分钟,蛋白质在 SDS 和β-巯基乙醇的作用下,变性,形成紧密的棒状 SDS -蛋白质复合物。蛋白质浓度在0.5mg/ml左右为宜。用微量注射器吸取50微升样品。注入点样孔中。
4.电泳,加样后,向两槽内注入电极 缓冲液 ,接通电源,上槽接电源负极,下槽接正极,开始控制电流为15-20毫安,染料进入分离胶后,加大到30毫安,电压在80-120伏。当指示染料到达胶长的四分之三以上时,即可停止电泳,电泳约需3-4小时,若用盘状电泳。当初始电流控制在每管1毫安,样品进入分离胶后,增大到每管2-3毫安,维持恒流,电泳约需3小时。
5.染色 胶取出后,在水中浸泡10分钟,浸出部分SDS,并用细铜丝对溴酚蓝带的位置进行标记,然后浸入考马斯亮蓝R250溶液中,30℃染色1小时,然后用水冲洗去凝胶表面的染料,放入脱色液中,于37℃下脱色1-2天,期间要经常更换脱色液。
五.结果计算
SDS-PAGE 低分子量标准蛋白质

以相对迁移率(mR)为横坐标,相对分子量(Mr)的对数值为纵坐标。
在半对数坐标纸上作图,可得到一条直线,然后根据未知蛋白的迁移率,在半
对数坐标上查出其对应的分子量。
五、注意事项
1.在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水。
2.样品液在加样前需在沸水中加热几分钟。
3.电泳时,电流不可太大,太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行,以便于散热。

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