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电泳技术及其应用

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一:电泳(Electrophoresis):带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。
电泳分析技术:利用电泳现象进行物质分离的技术。
二:影响电泳的因素:
1. 带电粒子的带电状态(电量和电性)。
2. 带电粒子的分子量大小和分子形状。
3. 电场强度。
4. 缓冲液的PH 值,组成成分及离子强度。
5. 支持介质的吸附和电渗作用。
三:蛋白质电泳的机理
1. 蛋白质是两性电解质:
当 PH=PI 时,所带净电荷为零;当 PH>PI 时,所带净电荷为负;当 PH<PI 时,所带净电荷为正;当 PH
距离PI 越远时,所带电量越多。
2. 不同蛋白质等电点不同,在同一缓冲液中所带电性及电量不同,电泳时迁移的方向和速率不同。
3. 不同蛋白质分子量大小和分子形状不同,故迁移率不同。
四:实验:血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
(一) 原理:
1. 人血清蛋白质的分类,等电点,分子量及迁移率:

2. 在PH8.6 的缓冲液中均带负电,泳向正极。
3. 染色漂洗后,可见5 条带(定性)。
4.洗脱比色后可定量(今天不做)。
(二) 器材和 试剂 :
1. 电泳仪 2. 电泳槽 3. 载波片,点样器,镊子
4. 染缸 5. 醋纤膜 6. 巴比妥缓冲液
7. 氨基黑染液 8. 漂洗液
(三) 操作:
1. 准备:
1) 将缓冲液倒于电泳槽中(每池约500ml)。
2) 将醋纤膜浸泡在缓冲液中20min。
3) 每人取一张醋纤膜(用镊子夹取),用滤纸吸干水分,找到粗糙面,在距一端2cm 处划点样线,用铅笔或圆珠笔写上学号。
2. 加样:用加样器加样;取样要适量、均匀(点样器下端均匀沾有一层 血清 即可);点样于划线处,点样
时用力要均匀,只能点一次。
3. 上桥:粗糙面向下,点样端位于负极。纱布搭桥。
4. 平衡:盖上盖子,静置5min。
5. 电泳:120V,电泳45min(电泳使不得用手触摸电泳槽内任何物品,以防触电)。
6. 染色和漂洗:染色5min;初漂、次漂各2min:用镊
子夹拄醋纤膜轻轻摇动,或轻轻晃动染缸。
7. 定量:剪下各条带,洗脱,比色。(不做)
(四) 结果:参见原理。
(五) 临床意义:
1. 白蛋白降低:
1) 合成能力不足:肝功能下降。
2) 合成原料不足:饥饿,腹泻,肿瘤晚期。
3) 去路增加:肾病综合症,严重烧伤,大出血等。
4) 消耗过多:糖尿病,甲亢等
2. 球蛋白增加:感染,多发性骨髓瘤,自身免疫性疾病等。
3. 球蛋白降低:皮质功能亢进,免疫缺陷病。
4. 肝病时:A ,α2-G ,β- G ,α1- G , γ- G A/G下降甚至倒置。
5. 肾病时:
1) 早期:选择性蛋白尿:分子量较小的蛋白质丢失,含量下降。如白蛋白。
2) 后期:非选择性蛋白尿:除分子量较小的蛋白质丢失,含量下降外,分子量较大的蛋白质(如γ- 球蛋白)也丢失,含量也下降。

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