芯片
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最近, 在后基因组时代纷繁的信息中,
生物芯片
看起来成了最重要的研究工具之一. 生物芯片与电子工程学中的硅半导体芯片非常相似. 高密度小尺寸的DNA和蛋白质芯片被用来筛选生物信息, 以便于更快更好的研究.
纳米基因芯片
DNA芯片是现代芯片技术中最成功的案例. DNA技术使用了DNA双螺旋链中A-T和G-C这样的Watson-Crick对的的典型的性质以及对互补序列识别的性质. 换句话说, DNA芯片上的单链被当作诱饵, 而当 加入DNA试样时候, 只有其互补链与之成键. DNA芯片能包含数千到数十万种DNA诱饵, 这样就可以筛选任意数量的DNA样品. 因此审查的速度是令人惊异的. 因为在一枚芯片上的DNA诱饵的序列都已知, 重要的是找出要筛选的DNA与哪一位置结合. 为检测诱饵-样品DNA成键的数量, 通常样品DNA被涂以萤光染料然后扫描机读取芯片上的荧光强度. 强荧光度意味着样品中有许多互补DNA链与诱饵DNA链成键. 现在正在发展高灵敏度的电子筛选法, 但是还没有制造出来.
有二个方法可以植入DNA芯片上的诱饵: 一是使用化学合成(照相平版术)逐步累积单个低聚物, 另一是在芯片上(多针排列)点现成的样品. 现在, Affimetrix 作为领先的DNA芯片公司, 已使用制造计算机半导体芯片相同的技术. 他们使用光敏掩膜和光来选择性的在硅板上显露反应位点, 然后附上核酸. 因为核酸由A, T, C和G组成, 需要四套掩膜和四次反应. 现在可购得的 affiy芯片包含25个核酸, 这需要100个掩膜和反应. 一种新的芯片布满光活性罩, 当光选择性的通过掩膜时, 反应物基团被暴露于光线之下然后与下面的个体反应. Affimetrix正在生产酵母, 人, 小鼠和其他的DNA芯片, 而且这些被用于一次测量所有的基因表达. 但是, 普通的基因由数以千计的碱基组成, 使用只有25个碱基的低聚物有试样是否具有代表性的问题. 因此, Affimetrix 制造每个基因含20碱基的芯片(每个低聚物是25-mer), 而且判断相关基因的表达要经过一个统计过程以确保达到足够的DNA序列量. 这样, 样品DNA需要剪切到与诱饵DNA体积相当.
Affiy芯片
尽管照相平版术是芯片合成的代表性方法, 它对芯片密度和光衍射的限制饱受批评. 1999年九月期的Nature Biotechnology上, 威斯康辛大学Madison分校的 Michael Sussman 博士团队的科学家引入了一个不要掩膜而使用数码照相处理器的合成方法. 他们使用小的矾土来激发光以代替掩膜, 他们的方法使本来需要的几周时间缩短到8个小时, 大大降低了芯片成本. 新技术当经由威斯康辛校友研究基金取得专利权, NimbleGen Systems 系统正在购买这项技术.
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http://www.devicelink.com/ivdt/archive/98/09/009.html
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在斯坦福大学的 Patric Brown 发明了多针矩阵方法. DNA诱饵探头通过PCR等生物技术被合成, 然后点到微型玻璃芯片上. 除了对于实验重现性的批评, 只要有DNA诱饵探头, 这种方法就较合成芯片有更具竞争力的价格. 现在任何人都可以容易地制造芯片. 因为诱饵DNA是生物制得的, 不像Affy芯片, DNA长度没有任何限制. 甚至数百个碱基的构成的DNA也能制得, 这个优点使得较诱饵-样品成键法有更高的选择性.
多针矩阵
<http://www.bohan.co.kr/html/DNAChip/DNAChip-1.htm>
现在许多芯片正在使用cDNA诱饵. 从特定条件下的细胞得来的mRNA被取出, 经过几步处理后, 人们研究它们是何种基因, 在给定条件下有多少被表达.当mRNA的量不足的时候, RT-PCR及体外传递方法可以用来倍增它. 得到数据和样品较探测蛋白质表达数量要简单, 这是一大优点, 可是也有批评指出mRNA的量得变化并不精确表明蛋白质数量的变化. 换句话说, 某蛋白质表达细胞的尝试能通过mRNA的量发现, 但是否真正制得了蛋白质无法核对. 有道理. 事实上mRNA的量和蛋白质没有很多的相互关系(比0.5低). 因为mRNA和蛋白质的分解速率不同, 而且蛋白质经过一系列反应(例如磷酸化作用), 不能说 一个mRNA制得一个蛋白质. 如果总的DNA被称作基因组, 总的蛋白质称作蛋白质组, 那么DNA芯片的研究就可以被称为转录组(transriptome), 因为这其中使用了mRNA.
除此之外, 因为每个基因的转录mRNA量是不同的, 如果没有标准就很难将来自不同细胞或系统的mRNA的量相比较. 因此, 通过控制实验条件的mRNA相对量的变化以及真实实验下的量非常重要. 例如, 可以说,"当对细胞突然加热时, 与基因A相关的mRNA增加了2.5倍. 所以, 至少需要两个实验, 控制条件的和真实的. 对于现在用的 Affiy芯片, mRNA被取出, cDNA被逆转录, 而且样品的量由于体外转录制得的cRNA而倍增. 在转录步骤中, 因为维生素H被加到一些U或T上, 而且使用萤光streptavidin检测, 每个芯片应该单独用于每个试样, 然后比较. 另一方面, 最近有为基因组, SNP还有mRNA 分析而制造的DNA芯片.
<http://www.iir.suite.dk/IIR/Genes/geneChipSetup.htm>
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http://www.iir.suite.dk/IIR/Genes/geneChipDK.htm
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然而, 在布朗法中, 试样是用不同荧光染料染色了的 ( Cy3 & Cy5 ), 一起点在一个芯片上, 而且检测由于mRNA表达引起的颜色相对改变. Cy3和Cy5事实上都是红色染料, 为了数据分析和表达的方便, 它们被当作绿色和红色的. 举例来说, 如果控制实验是绿色的而真实实验是红色的, 没有mRNA的基因将会被指定为黄色的, 一种中间色. 另外绿色的基因表示表达的减少, 红色的基因意味着表达的增加.
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http://www.dkfz-heidelberg.de/kompl_genome/index.html
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因为布朗的方法容易而且便宜, 只用一个点样器和一个检测仪来制造芯片, 许多学校的研究小组正在使用这种方法. 但是问题集中在重复实验的真实性上. Incyte , 过去一直通过收集来自不同研究小组的DNA诱饵来提供标准DNA芯片, 宣布在2001年底停止他们的服务. 这对许多研究小组研究DNA的计划来说是一个危机, 据信, 他们正在找寻新的服务供给者( Nature , 2001 , 414 , 135-136 ).
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由于利用了DNA与互补的DNA或RNA结合的典型性质, DNA 芯片在短时间内就取得了成功. 然而, 已经有关于mRNA 和蛋白质之间数量关系上的争论, 而且实际上在细胞中参与各种不同反应的都是蛋白质. 因此, 如果能制造出蛋白质芯片而不是DNA芯片, 而且如果蛋白质表达强度和键合物能被发现, 就有可能把研究拓展到DNA芯片鞭长莫及的领域. 然而, 要制造一个蛋白质芯片, 每个蛋白质都需要提纯, 还有, 将蛋白质以某种形式固定到芯片上的技术还不完善. 也许植入较常规蛋白质易于控制的抗体是个替代方案.
尽管被指出了许多问题, 2000年秋天, Schreiber小组展示了他们可以制造高密度蛋白质芯片并且保持蛋白质成键能力的技术(
Science, 2000, 289, 1760-1763
). 它与布朗技术相同, 除了他们用了蛋白质而不是DNA. 以醛基活化光滑的表面, 蛋白质通过共价键与之相连.他们用了几种不同的蛋白质做芯片能保持活性的例证, 但是不同蛋白质在芯片上能否互不干扰仍是个问题.
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http://www.cgr.harvard.edu/macbeath/index.html
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2001年, 覆盖了芽孢酵母大部份基因产物的大约6,000种蛋白质, 被表达并在N-末端以GST- HisX6(glutoahione S-转移酶-聚组氨酸)标记, 然后植入芯片. 这项工作是耶鲁大学的 Snyder 小组完成的( Science , 2001 , 293 , 2101-2105).通过光滑的玻璃表面上的醛基或Ni离子包裹(与HisX6成键)使蛋白质平滑地附到芯片之上. 平均分配的点入的蛋白质通过萤光标记的GST抗体确认. 对钙调素(calmodulin)和磷酸肌醇酯(phosphoinositol lipid), 两个代表性的蛋白质成键方式, 进行萤光标记然后在芯片上筛选, 以此证明蛋白质间的相互成键能力并用其识别新的成键的蛋白质. 现在, 蛋白质芯片的检测灵敏度约为ng/mL.
蛋白质芯片公司 Ciphergen 在芯片表面包裹了各种材料, 利用这些不同的表面区别不同的蛋白质. 设计的表面材料有憎水型的, 亲水型的, 阳离子和阴离子交换型的, 金属离子和潜活性分子等等, 但是好像仅用这些有限数量的表面来识别数以千计的不同蛋白质比较困难. 与芯片成键的蛋白质采用MALDI-TOF质谱进行分析.
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如果是小分子芯片而不是蛋白质芯片那会怎样呢? 那将会是一个非常诱人的方法, 如果药物候选分子可与蛋白质成键, 那就可以将其置于高密度芯片之上. 尤其筛选大量来自文库的化合物的时候, 我们现在的筛选需要耗费太多时间和精力. Schreiber的小组发明了一项技术, 可以合成小分子并且使用分子的酸性基团将它们点到底部活化的芯片上. 但是，仍然缺少实证层面上的论文. 尽管基础技术的发明层出不穷, 一个具有实际价值的芯片仍然等待人们去开发.
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http://www.cgr.harvard.edu/macbeath/index.html
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2001年, Schultz小组通过联合使用PNA(肽核酸)标记的小分子和DNA地址芯片技术而发展了新的小分子芯片( Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 2001 , 40 , 3152-3155).十年前就发展了单珠单分子下的编码和解码法, 但是给标记合成编码需要额外的化学修正, 而且由于珠子的体积合成化合物的量受到限制. 在新方法中, PNA是编码标记, 带有标记的文库化合物直接与芯片上对应的DNA序列相关联. 结果是, PNA和DNA形成双螺旋, 小分子文库化合物露在双链的顶端. 通过对芯片上特定地址解码来识别化合物. 实验使用的例子是 cyctein蛋白酶抑制剂, 证明了PNA标记不干扰抑制剂的活性. 然而, 这些以PNA标记的分子将不能穿透细胞膜, 这对于以细胞为基础的筛选可能不太合适.
许多公司宣称他们具有小分子芯片技术, 但是他们大部份是为高通量筛选准备的小圆片或薄膜排列. 一家德国的新诞生的公司, Graffinity , 才是真的用共价键将小分子附到芯片表面, 并以蛋白质键筛选. 他们合成含硫末端的小分子然后利用S与Au间的强键将这些分子连到金的表面. 利用 Biacore Inc. 的 SPR (表面等离子体共振)技术测量蛋白质成键. 当他们不需要用萤光探头标记蛋白质时由于硫易反应的内在本质, 分子不适合作功能化验.
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不只有DNA或蛋白质, 还有整个细胞或器官也能布置在玻璃表面上从而制得细胞芯片或组织芯片. 举例来说, 如果你想要找与细胞膜受体成键的配体, 你需要布置整个细胞而不是提纯受体并用其点板. 如果矩阵由不同的细胞组成, 将会容易地辨认出与细胞特异性成键配体. 这种方法应用将会很广. 例如, 如果配体与一个特定的癌细胞成键, 对照 试剂 或者毒素取代物将会连到配体上, 然后对每个做图像分析和处理.
相反, 小分子或基因排列将会在一个芯片上被制备, 而且细胞应用在它上面. 当细胞连接到芯片上的每个遗传材料时, 每个基因将会缓慢地释放而且吸收到细胞内, 正如病媒动物的行为一样. 如果病媒动物表达细胞表面的受体, 受体序列将会在细胞表面上被构造, 为将来的化验做筛选.
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大部分芯片实验要求多步样品制备过程, 例如DNA, RNA 或蛋白质萃取倍增等, 在重复时可能产生不可预知的人为误差和变化. 举例来说, RNA样品易于被少量的RNase分解, 而RNase可能由实验者的皮肤或有黏液的组织产生. 蛋白质也因环境因素不同程度的改变本性. 为了要减少这些种人为的误差, 芯片上的整个制备步骤的自动化引发人们极大的兴趣, 这种方法称作芯片实验室. 芯片实验室的成功结果将会得带一个测试芯片去任何地点测试 生物 学的样品, 例如血液, 并进一步实时实地得到想要的数据成为可能.
小的, 廉价的而且高敏感度的芯片的发展将会在交叉学科研究MEMS(微电子机械系统)的帮助下成为可能, 这是物理学, 化学, 机械和电子工程学的知识的汇合.
