影响酶作用的因素
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【 实验目的 】
1.掌握温度对酶活性的影响;
2.掌握酶活性的最适pH及掌握一种检测最适pH的方法;
3.掌握激活剂和抑制剂对酶活性的影响。
【 器材和 试剂 】
1.器材
试管及试管架、烧杯、恒温水浴箱、冰块、白瓷板
2. 试剂
(1)0.5%淀粉液、0.2%淀粉液
(2)0.3%NaCl溶液、0.85%NaCl溶液。
(3)不同pH值缓冲液的配置:①1/15mol/LKH 2 PO 4 液:称取纯KH 2 PO 4 9.078g/>,,加蒸馏水溶解并稀释至1000ml。②1/15mol/L Na 2 HPO 4 液:称取纯Na 2 HPO 4 ·2H 2 O 11.815g/>,加蒸馏水溶解并稀释至1000ml。
两液按下表比例混合均匀,即可得各pH的缓冲液。
(4)碘化钾-碘溶液:将碘化钾 20g/>及碘 10g/>溶于100ml水中。使用前稀释10倍。
(5)1%CuSO 4 溶液。
(6)1%Na 2 SO 4 溶液。
【实验内容】
(一)温度对酶活性的影响
【 实验原理 】
由于酶是 生物 催化剂,其本质是蛋白质。因此,对温度敏感是酶的一个重要特性,温度对酶促反应速度具有双重影响。
酶作为 生物 催化剂,和一般催化剂一样呈现出温度效应,一方面,升高温度可以增加活化分子数目,提高酶促反应速度,另一方面,当温度超过一定范围时,又会加速酶蛋白的变性速度,增加了酶的热变性。所以在较低的温度范围内,升高温度增加活化分子数目,酶反应速度随温度升高而增大,加快反应速度这一效应起主导作用;但是超过一定温度后,温度继续升高,酶的变性失活起主导作用,反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度。在最适温度下,酶的反应速度最高。酶的最适温度不是一个常数,它与作用时间的长短有关系。
大多数动物酶的最适温度为 37~40℃,植物酶的最适温度为50~60℃。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂,虽加热到 100℃/>,其活性并无明显改变,但在 100℃/>的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性,但不能使酶失活。
本实验以唾液淀粉酶为例。在不同温度下,淀粉被唾液淀粉酶水解的程度,可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小,遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不显颜色,麦芽糖遇碘也不显色。
淀粉-------------→糊精-----------→麦芽糖
遇碘:蓝色--------→紫色至红色--------→碘色
【 操作步骤 】
1.制备稀唾液。用蒸馏水漱口,以清除食物残渣,再含少许蒸馏水,作咀嚼动作以刺激唾液分泌。取小漏斗1个,垫小块薄薄的脱脂棉,直接将唾液吐入小漏斗,取得滤液,加水至9ml,混匀备用。
2.取小 试管 3支,编号,按下表加入各种试剂。
3.混匀后,将1号、2号、3号 试管 分别置于沸 水浴 、温 水浴 (37~ 40℃/>)和冰浴中5min,向各管加入稀唾液3滴,继续在原水浴中放置5min。
4.各管取出2滴试液在白瓷板上,观察颜色并记录。
5.然后再将1、3两管置 37℃/>水浴中5 min,各管中加碘液,观察颜色变化并分析。
(二) pH 、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
【 实验原理 】
环境pH直接影响到酶和底物的解离状态,从而影响到酶与底物的结合和反应速度。在某一定pH时,酶活性大最大值,这一pH成为酶的最适pH。环境pH高于或低于最适pH时,酶的活性降低,远离最适pH时,甚至会导致酶的变性失活。不同的酶最适pH不尽相同。酶的最适pH不是一个特征性的物理常数,对于一个酶,其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。
人体多数酶的最适pH在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适pH为6.8。
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使酶由无活性变为有活性,或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂,激活剂大多为金属离子,如Mg 2+ 、K + 、Mn 2+ 等,少数为阴离子,如Cl - 等,也有许多有机化合物激活剂,如胆汁酸盐等。凡能抑制酶促反应的物质,统称抑制剂。很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性,而且常具有特异性,如Cl - 对唾液淀粉酶酶的活性有激活作用,Cu 2+ 对其则有抑制作用。但激活剂和抑制剂不是绝对的,浓度的改变可能使激活剂变成抑制剂。
本实验以唾液淀粉酶为例,观察pH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响,观察淀粉水解的方法同前。
【 操作步骤 】
取 试管 7支,编号,按下表加入试剂
将各管混匀后,同时置于37~ 40℃/>水浴中保温。约1min后,由第3管取出1滴置白瓷板上作碘反应,观察颜色,呈棕色,(如为蓝色,则仍每间隔1min作一次碘反应)。将各管取出,各加碘液2滴,摇匀,观察并解释其结果。
【 思考题 】
1.唾液淀粉酶的最适温度是多少?
2.低温对酶有什么影响?
3.在第二个实验中,为什么以第3管作碘反应,观察颜色?有何意义?
4在第二个实验中,为什么要作CuSO 4 、Na 2 SO 4 的对照实验?