质粒DNA的提取与鉴定

实验三 质粒 DNA 的提取与鉴定

 

[ 实验目的 ]

通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒。

[ 实验原理 ]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[ 实验 仪器 与设备 ]

1.恒温培养箱 2.恒温摇床

3.台式离心机(最大转速4000rpm) 4.冷冻高速离心机

5.高压灭菌锅 6.超净工作台

7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip

[ 实验材料 ]

1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)

3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠

5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾

7.冰乙酸 8.氯仿

9.乙醇 10.胰RNA酶

11.氨苄青霉素 12.蔗糖

13.溴酚蓝 14.酚

15.β巯基乙醇 16.盐酸

17.含pUC18质粒的大肠杆菌

 

 

附： 试剂 的配制

1.溶液Ⅰ

50mmol/L 葡萄糖

5mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)

10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2.溶液Ⅱ

0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合

3.溶液Ⅲ

5mmol/L 乙酸钾 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

4.TE缓冲液

10mmol/L Tris·HCl

1 mmol/L EDTA(pH8.0)

5.70%乙醇(放 -20℃ 冰箱中,用后即放回)

6.胰RNA酶

将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于 100℃ 加热15min,缓慢冷却至室温，保存于 -20℃ 。

7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚

8.酚

[ 实验步骤 ]

(一) 提取质粒

1．将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌， 37℃ 振荡培养过夜。

2．取1.5ml培养物倒入微量 离心管 中，4000rpm，离心2min。

3．吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4．将细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10 min。

5．加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），混匀内容物，将 离心管 放冰上5 min。

6．加入150μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。

7．1200rpm，离心15 min，将上清转至另一离心管中。

8．向上清中加入等体积酚：氯仿(去蛋白)，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中.

9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10．用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

11．加50μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解， -20℃ 保存。

（二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA

方法参见实验二

[ 作业 ]

1. 碱裂解法提取质粒DNA 的原理是什么？

2. 用 凝胶成像 系统拍照质粒DNA电泳图，并分析电泳所得条带

[ 实验安排 ]

共12学时，学生（6学时）

第1天下午 - 第2天上午：配LB培养基，接种，液体培养

第2天下午：质粒DNA的提取

第2天晚上：质粒DNA的检测