小鼠β-actin基因的克隆表达
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- 动物组织 RNA 的提取
实验目的: 掌握由动物组织中提取总RNA的方法
实验原理: Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液,其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性,随后加入氯仿,酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同,造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中,RNA则分布在上层的水相中,最后用异丙醇沉淀水相中的RNA,并用70%乙醇洗涤沉淀,这样就可以得到比较纯净的总RNA.
实验步骤:
① 先在研钵中加入液氮,再将组织剪成 小 块在液氮中磨成粉末,用液氮预冷的药匙取50~100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中(注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%),充分混合均匀。
② 室温放置5min,然后加入200µl的氯仿,盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。
③ 12000rpm离心10min,取上层水相于一新的EP管中(千万不要将中间的沉淀层和下层液混入,否则重新离心分离),加入500µl异丙醇,温和颠倒混匀。室温放置10min,12000rpm离心10min。
④ 小心地弃去上清液,加入1ml的75%乙醇,涡旋混匀,4℃下12000rpm离心5min。重复操作一次。
⑤ 弃去上清液(尽量将残余液体除去),室温或真空干燥5~10min(注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度)。用30µl DEPC处理过的水将RNA溶解,必要时可55℃~60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
另外,还可以通过试剂盒提取总RNA, 操作步骤见试剂盒说明。
- RT-PCR 扩增目的基因及琼脂糖电泳分析
实验目的: 掌握通过RT-PCR方法由真核生物的总RNA中获得目的基因的方法,并通过琼脂糖电泳对扩增结果进行定性检测。
实验原理: 由于真核生物的mRNA的3′端存在 Poly(A)尾,这样以olig(dT)为引物,在逆转录酶的催化下,就可以合成互补DNA(cDNA),然后以cDNA为模板,利用目的基因扩增引物进行PCR就可以扩增出目的基因。
实验步骤:
RNA 的反转录
① 在 小 EP管中依次加入
RNA模板 3 μl
Olig(dT) 18 引物 1μL
DEPC H 2 O 8 μL
混合后,70℃水浴5 min(破坏二级结构),再冰浴5min。
② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL):
RT 5×buffer 4μL
RNasin 1μL
dNTP ( 10mM) 2μL
混匀,37℃ 5min。
M-MULV反转录酶 1 μL
置于 42℃水浴,1h。
③ 70℃保温5min(使酶失活)。
④ 于-20℃保存备用。
PCR 扩增目的基因
以反转录产物为模板,克隆引物B1,B2为引物,利用rTaq酶进行扩增目的基因,用于后续连入克隆载体的操作,然后再以表达引物EB1,EB2为引物,利用Pfu DNA聚合酶进行扩增目的基因,用于后续连入表达载体的操作。
94 ℃ 3 min
94 ℃ 45Sec
30 cycles: 57 ℃ 45Sec
72 ℃ 45Sec
72 ℃ 5min