小鼠β-actin基因的克隆表达

1. 动物组织 RNA 的提取

实验目的： 掌握由动物组织中提取总RNA的方法

实验原理： Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液，其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性，随后加入氯仿，酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中，RNA则分布在上层的水相中，最后用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，这样就可以得到比较纯净的总RNA.

实验步骤：

① 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成 小 块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。

② 室温放置5min，然后加入200µl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。

③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。

④ 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。重复操作一次。

⑤ 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µl DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

另外，还可以通过试剂盒提取总RNA， 操作步骤见试剂盒说明。

1. RT-PCR 扩增目的基因及琼脂糖电泳分析

实验目的： 掌握通过RT-PCR方法由真核生物的总RNA中获得目的基因的方法，并通过琼脂糖电泳对扩增结果进行定性检测。

实验原理： 由于真核生物的mRNA的3′端存在 Poly(A)尾，这样以olig（dT）为引物，在逆转录酶的催化下，就可以合成互补DNA（cDNA），然后以cDNA为模板，利用目的基因扩增引物进行PCR就可以扩增出目的基因。

实验步骤：

RNA 的反转录

① 在 小 EP管中依次加入

RNA模板 3 μl

Olig（dT） ₁₈ 引物 1μL

DEPC H ₂ O 8 μL

混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），再冰浴5min。

② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL)：

RT 5×buffer 4μL

RNasin 1μL

dNTP ( 10mM) 2μL

混匀，37℃ 5min。

M-MULV反转录酶 1 μL

置于 42℃水浴，1h。

③ 70℃保温5min（使酶失活）。

④ 于-20℃保存备用。

PCR 扩增目的基因

以反转录产物为模板，克隆引物B1，B2为引物，利用rTaq酶进行扩增目的基因，用于后续连入克隆载体的操作，然后再以表达引物EB1，EB2为引物，利用Pfu DNA聚合酶进行扩增目的基因，用于后续连入表达载体的操作。

94 ℃ 3 min
 

94 ℃ 45Sec

30 cycles: 57 ℃ 45Sec

72 ℃ 45Sec

72 ℃ 5min