扩增基础上的已知点突变检测进展

杨卫华 综述 李 稻 审阅

 

上海第二医科大学 上海市医学检验重点实验室（上海，200023）

摘要： 在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题。本文着重介绍了几种近年发展起来的新技术：反向限制性位点突变分析(iRSM)、荧光PCR（SYBR Green I结合熔解曲线分析技术、荧光共振能量转移(FRET)结合探针熔解曲线分析技术）、基因芯片、等位基因特异性扩增技术(ASPCR)。 关键词 ：聚合酶链式反应 点突变 Tm值 荧光 基因芯片 等位基因 随着人类基因图谱草图的公布和各种病原体基因序列的揭示，这都将极大的促进疾病相关基因的结构和功能研究，特别是基因缺失、错位、突变（有义突变）等与疾病的关系。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例 ^[1] ，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。PCR扩增技术问世以来，建立于扩增基础上的突变检测技术使检测靶DNA（目的DNA）含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足等难题得以克服，使得分子诊断技术进入了新阶段。在过去十多年中，曾出现了诸如经典的PCR-RFLP、ASO以及OLA、COP、PEX等点突变的检测方法，本文将对近年来发展起来的对已知点突变分析方法进行综述。 ⒈ 反向限制性位点突变分析（inverse restriction site mutation , iRSM） 1978年Kan和 Dozy创立的限制性片断长度多态性（restriction fragment length

polymorphism , RFLP)连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法。其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了 ^[2] 。

图1.E1→E2突变的检测