随机扩增多态DNA 的方法和应用

DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990 年，Williams 和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams 等 1990； Welsh 等 1990）。尽管RAPD 技术诞生的时间不长，但由于其独到的DNA 多态性以及快速、简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段之一。本文将对RAPD 技术的基本原理和特点、基本操作程序以及RAPD 技术在检测物种遗传多样性中的应用作一简单的介绍。

1.RAPD 技术的原理和特点
RAPD 技术建立在PCR 技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB 染色或放射自显影来检测扩增产物DNA 片段的多态性，这些扩增DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA 多态性。

RAPD 所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组DNA 序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR 扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的3 端相距在一定长度范围之内，就可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生DNA 片段的插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR 产物的检测即可探知基因组DNA 在这些区域内的多态性。

进行RAPD 分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组DNA 多态性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD 可以对整个基因组进行多态性检测。

RAPD 技术与其他DNA 多态性检测技术如 RFLP （ restriction fragment length polymorphism）、DNA 指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD 技术可以在对受试物种（包括动物、植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作简便，一次RAPD 扩增实际上就是一次简单的PCR 反应，适合大量样本的快速分析；③所需模板DNA 量极少，一般一次扩增只需5～50ng 的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA 进行直接扩增。这对于珍稀濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的（王文等 1994；陈永久等 1997，1998；Gwakisa 等 1994；Yi 1995；Tibayrenc 等 1993；Wachira 1995）。

2. RAPD 的基本操作方法
RAPD 的操作方法大体上包括DNA 提取、扩增、电泳和染色等几个主要步骤。具体的操作过程见 Williams 等（1990，1993）和 Welsh 等（1990）的论述。随着 RAPD 技术的发展，该技术也作了一些改动（Bucci，Menozzi 1993；Dawson 等1993；Lawson 等1994）。
2.1 RAPD 模板的制备
2.l.1 动物组织总 DNA 的提取
取新鲜动物组织材料，如肝脏、肾脏或肌肉等10～100mg，剪碎后加入750μl 的STE（0.1mol／dm ³ NaCl，20mmol／dm ³ EDTA，10mmol／dm ³ Tris-HCl，pH 值 8.0）、80μl 10％SDS和8μl 20mg／ml 的蛋白酶K。在56℃下消化12～24／小时后，用酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次。每次抽提时间为12～24 小时。上清液用等体积的异丙醇沉淀及70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE 溶解，置于4℃冰箱中备用。(生物秀实验频道——打造专业生物实验中心 www.bbioo.com )
2.1.2 植物及其真菌的总DNA 提取
取50～500mg 植物或真菌的新鲜材料，分别经95％的乙醇、70％的乙醇和超净水清洗。将材料剪碎后，在材料中加入700μl 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液（2％CTAB，1.4mol／dm ³ NaCl，0.2％ 2-巯基乙醇，20mmol／dm ³ EDTA，100mmol／dm ³ Tris-HCl，pH 值8.0）。在56℃下消化12～24 小时。用酚、酚－氯仿－异戊醇（25:24:1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次，每次抽提时间为12～24 小时。将上清液用等体积的异丙醇沉淀后，用70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE 溶解，然后置于 4℃冰箱中备用。

2.2 RAPD 反应体系
2.2.1 RAPD 反应的仪器和试剂
用于 RAPD 扩增的实验仪器主要是一台 PCR 扩增仪。由于 RAPD 反应中的引物和模板之间的结合是随机的，因此我们建议使用一台固定的PCR 扩增仪进行RAPD 反应。
RAPD 反应的试剂有：①PCR 缓冲液，各家公司生产的TaqDNA 酶均配有相应的缓冲液； ② dNTP， 包括 dATP， dGTP， dCTP 和dTTP 4 种，每种浓度为25mmol／ dm ³ ； ③MgCl ₂ 25mmol／dm ³ ；④随机引物，美国Opren 公司生产800 种随机引物，其他一些公司也有生产；⑤牛血清白蛋白（BSA） 10mg／ ml，或明胶 0.01％；③TaqDNA 聚合酶。