错配PCR-限制性片段长度多态性分析检测HBV前终止密码变异株技术

错配PCR-限制性片段长度多态性分析检测HBV前终止密码变异株

技术的建立及临床应用

周伯平 徐六妹 王火生 付涌水

李卫宁 韩红星 马为民 袁 静

深圳市东湖医院 深圳市肝病研究所 518003

摘要 采用错配聚合酶链反应(mpPCR)对HBV前C区基因进行扩增，对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)，鉴定前C区第83位核苷酸点突变。并对PCR产物进行核苷酸序列分析以鉴定其特异性。通过对不同含量HBV DNA&127;的阳性血清检测结果显示本法可检出10 ⁵ copies/ml的HBV DNA，测序结果证实PCR产物为HBV前C区特异性序列，与RFLP分析结果相符。采用mpPCR-RFLP对74份慢性乙型肝炎患者血清进行检测，结果17例前C区终止密码变异(23%)，其中8例抗-HBe&127;阳性的变异株感染者有1例为慢性重症肝炎；5例肝功能反复异常，提示多数前C区变异株HBV感染者伴有活动性肝病。采用本法检测前C区变异株HBV感染，操作简单，特异性与敏感性好，试验结果稳定，适用于临床推广应用。

关键词 乙型肝炎病毒 基因变异 PCR RFLP

Detection of A83 Mutation in HBV PreC Region by Mispairing PCR-RFLP Zhou Baiping, Xu Liumei, Wang Huosheng, et al. Shenzhen Research Institute of Hepatology, Shenzhen ，518003

Abstract A83 point mutation at HBV preC &127;region &127;was &127;detected &127;by &127;a mispairing polymerase chain reaction (mpPCR) with restriction fragment length polymorphism analysis. &127;The &127;PCR &127;products &127;were &127;sequenced &127;to confirm its specificity . By using this assay, &127;we &127;tested &127;the &127;serum samples of 74 patients with chronic hepatitis B. As a result, the G-&127;A point mutation at nucleotide 83(A83) in the preC region of HBV &127;genome was found in 17 out of the total 74 cases(23%). &127;The &127;results &127;suggest that the viral preC stop &127;codon &127;mutation &127;might &127;be &127;related &127;to &127;the chronic pathological activity. The mpPCR-RFLP assay for the &127;detection of HBV mutant with preC stop codon is simple, specific and &127;sensitive, may serve as a valuable tool in the clinical diagnosis.

Key words Hepatitis B virus Mutation Polymerase chain reaction

Restriction fragment length polymorphism.

既往认为在慢性乙型肝炎病毒感染过程中，血清HBeAg的消失，抗-HBe&127;的出现意味着病毒复制的停止与病变活动的缓解。然而，近年来发现一些抗-HBe阳性，但仍有HBV复制的活动性肝炎患者 ^[1] &127;。&127;进一步研究发现这类肝炎患者体内存在一种HBV变异株 ^[2,3] 。HBV前C区第83位的核苷酸由G&127;变为A&127;导致28&127;位密码子由色氨酸(TGG)变为终止密码子(TAG)，由于该变异使病毒不能编码HBeAg，肝细胞表面靶抗原HBeAg消失，一方面使病毒发生免疫逃逸 ^[4] ，使得HBV得以长期持续，另一方面HBeAg消失还导致免疫耐受性的减退 ^[5] ，因而诱发炎症活动。这是HBV&127;最常见的变异 ^[6] ，具有重要临床意义。

过去检测这种点突变一般是通过复杂的核苷酸序列分析，难以在临床中应用。为此，我们根据错配PCR-限制性片段长度多态性分析(misparing &127;PCR-restriction fragment length polymorphism method,mpPCR-RFLP)的原理 ^[7,8] ，并参照有关文献 ^[9] ，建立了一种检测HBV前C区终止密码变异株的改良mpPCR-&127;RFLP技术，用于临床HBV前C区终止密码变异株感染的诊断，现将结果报告如下。