CTAB法制备超螺旋质粒DNA
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摘 要：研究了基因治疗用载体质粒 DNA 的一种非色谱的大规模纯化方法—CTAB 沉淀法，并对其进行了工艺优化. 首先采用高纯过滤介质 CelPure 去除大量杂质，并利用 CTAB 浓度梯度溶液研究了不同形式 DNA(超螺旋质粒 DNA、 切口质粒 DNA、线性质粒 DNA、染色体 DNA)沉淀能力的差异，选择性地从蛋白质、RNA 及其他形式 DNA 中提取 超螺旋质粒 DNA. 针对含有 pcDNA3 的 DH5α菌株，确定 CTAB 完全沉淀超螺旋质粒 DNA 的浓度为 2.0 g/L，由 NaCl 对不同沉淀的溶解能力，确定溶解沉淀的最优盐浓度为 0.75 mol/L. 用此方法得到的超螺旋质粒 DNA 的纯度达 90% 以上，收率为 78.94%. RNA、蛋白质残量以及内毒素均符合药品质量标准要求. CTAB 对质粒 DNA 的沉淀效果与质粒 DNA 的初始浓度有关，并且超螺旋质粒 DNA 浓度的降低与 CTAB 的添加量呈一定的线性关系. 超螺旋质粒的分子量 越小越不易被分离，并且结构特性比分子量在分离过程中更据主导作用.
关键词：质粒 DNA；大规模纯化；溴化十六烷三甲基铵(CTAB)
1 前 言 随着基因治疗和 DNA 疫苗的迅速发展，质粒 DNA 的提取方法受到人们更多的关注[1−4] . 从目前情况来看， 大规模制备超螺旋质粒 DNA 主要采用色谱法[5−7] ，但由 于商品化的色谱介质孔径较小(<100 nm)，而质粒 DNA 分子量较大(5∼20 kb)，大大降低了介质的吸附容量，并 且临床上用于基因治疗的质粒 DNA 注射剂量又要求较 大，因此大规模制备超螺旋质粒 DNA 的方法还有待简 化和改进.
Ishaqu 等[8] 利用溴化十六烷三甲基铵(CTAB)沉淀 质粒 DNA，最终利用色谱进行纯化. CTAB 是一种阳离 子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性， 并且能基于线状、环状及超螺旋质粒 DNA 构象的差异， 使质粒与 CTAB 间的中和反应在分子间按序发生，超螺 旋质粒 DNA 处于拓扑缠绕状态，其与 CTAB 的吸附能 力较弱，最后从溶液中沉淀出来. 利用此方法还可去除 蛋白质、RNA、内毒素等杂质[9] . 本研究用 CTAB 沉淀 法从 E. coli DH5α中提取 pcDNA3 质粒……
全文下载： http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/07/08/B1372750416.pdf
关键词：质粒 DNA；大规模纯化；溴化十六烷三甲基铵(CTAB)
1 前 言 随着基因治疗和 DNA 疫苗的迅速发展，质粒 DNA 的提取方法受到人们更多的关注[1−4] . 从目前情况来看， 大规模制备超螺旋质粒 DNA 主要采用色谱法[5−7] ，但由 于商品化的色谱介质孔径较小(<100 nm)，而质粒 DNA 分子量较大(5∼20 kb)，大大降低了介质的吸附容量，并 且临床上用于基因治疗的质粒 DNA 注射剂量又要求较 大，因此大规模制备超螺旋质粒 DNA 的方法还有待简 化和改进.
Ishaqu 等[8] 利用溴化十六烷三甲基铵(CTAB)沉淀 质粒 DNA，最终利用色谱进行纯化. CTAB 是一种阳离 子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性， 并且能基于线状、环状及超螺旋质粒 DNA 构象的差异， 使质粒与 CTAB 间的中和反应在分子间按序发生，超螺 旋质粒 DNA 处于拓扑缠绕状态，其与 CTAB 的吸附能 力较弱，最后从溶液中沉淀出来. 利用此方法还可去除 蛋白质、RNA、内毒素等杂质[9] . 本研究用 CTAB 沉淀 法从 E. coli DH5α中提取 pcDNA3 质粒……
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