微生物发酵床垫料微生物总DNA提取方法的研究
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刘云浩
1,2
，蓝江林
2
，刘波
2
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，朱昌雄
1
，陈燕萍
2
（1.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081；2.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003）
发酵床养猪垫料是以谷壳、锯末、猪粪便加益生菌够成的发酵物，类似土壤，但又有区别于土壤，由于没有专门对应猪垫料DNA提取的试剂盒以及相应比较成熟的提取方法。故本采用试剂盒和相关文献的方法作为参考，对垫料总DNA的提取进行摸索。
样品采集自中国人民解放军73121部队福建福州新店养猪场，垫料使用时间3-5个月。分别采用土壤总DNA提取试剂盒法、粪便总DNA提取试剂盒法、淤泥总DNA提取试剂盒法、SDS法、CTAB 法和SDS-CTAB结合法提取养猪发酵床垫料微生物总DNA，对6种方法提取的DNA的浓度和纯度进行比较评价。
采用土壤总DNA提取试剂盒法提取四种垫料的DNA，所得到的DNA浓度最低，质量也很低，并且纯度也很低，A260/A280为2.0左右甚至更高，A260/A230为 0.3左右；粪便试剂盒提取法提取的DNA浓度最高，但是DNA质量和纯度不够高，A260/A280为1.5左右，A260/A230为0.3左右；淤泥总DNA提取试剂盒法只有A1的微生物总DNA纯度比较好，但浓度较低，A260/A280为1.5左右，A260/A230为 0.5左右；SDS法和CTAB法得到的DNA虽然浓度都很高，但是纯度都太低；只有SDS-CTAB结合法所提取的纯度最高，而且浓度也较高，A260/A280为1.8左右，A260/A230在 1.4以上。由于土壤总DNA提取试剂盒法所提取的DNA质量和浓度都很低，16S rDNA通用引物PCR扩增之后没有目的条带出现；而粪便试剂盒法，SDS法以及CTAB法提取的DNA含有大量的腐殖酸，并呈现出黄褐色，严重影响后续的PCR，以至于扩增不出目的条带；虽然淤泥总DNA试剂盒法提取的DNA纯度要高于上面的几种方法，但是提取的DNA也还是会呈现出淡黄色，所以在后续PCR时也只有一种垫料的DNA扩增出了目的条带，这对于不同发酵程度的垫料来讲，没有针对性；而SDS-CTAB法所提取的四种发酵程度不同的垫料的DNA都具有很高的纯度，DNA溶液比较清澈透明，直接DNA电泳能得到比较单一的条带，后续的PCR也能扩增出比较亮的目的条带。
综合分析表明，试剂盒法因为没有专门针对本实验垫料的DNA提取试剂盒，所采用粪便，土壤以及淤泥试剂盒都没有达到很好的效果，而在化学法当中，单纯的SDS法和CTAB法都不能有效除去腐殖酸和杂蛋白的污染，只有SDS-CTAB结合法提取的DNA具有完整性好，纯度高，不需要纯化直接就可用于PCR扩增，有利于进行下游的分子生态学研究。
关键词：垫料微生物 DNA提取 SDS-CTAB 16SrDNA
（1.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081；2.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003）
发酵床养猪垫料是以谷壳、锯末、猪粪便加益生菌够成的发酵物，类似土壤，但又有区别于土壤，由于没有专门对应猪垫料DNA提取的试剂盒以及相应比较成熟的提取方法。故本采用试剂盒和相关文献的方法作为参考，对垫料总DNA的提取进行摸索。
样品采集自中国人民解放军73121部队福建福州新店养猪场，垫料使用时间3-5个月。分别采用土壤总DNA提取试剂盒法、粪便总DNA提取试剂盒法、淤泥总DNA提取试剂盒法、SDS法、CTAB 法和SDS-CTAB结合法提取养猪发酵床垫料微生物总DNA，对6种方法提取的DNA的浓度和纯度进行比较评价。
采用土壤总DNA提取试剂盒法提取四种垫料的DNA，所得到的DNA浓度最低，质量也很低，并且纯度也很低，A260/A280为2.0左右甚至更高，A260/A230为 0.3左右；粪便试剂盒提取法提取的DNA浓度最高，但是DNA质量和纯度不够高，A260/A280为1.5左右，A260/A230为0.3左右；淤泥总DNA提取试剂盒法只有A1的微生物总DNA纯度比较好，但浓度较低，A260/A280为1.5左右，A260/A230为 0.5左右；SDS法和CTAB法得到的DNA虽然浓度都很高，但是纯度都太低；只有SDS-CTAB结合法所提取的纯度最高，而且浓度也较高，A260/A280为1.8左右，A260/A230在 1.4以上。由于土壤总DNA提取试剂盒法所提取的DNA质量和浓度都很低，16S rDNA通用引物PCR扩增之后没有目的条带出现；而粪便试剂盒法，SDS法以及CTAB法提取的DNA含有大量的腐殖酸，并呈现出黄褐色，严重影响后续的PCR，以至于扩增不出目的条带；虽然淤泥总DNA试剂盒法提取的DNA纯度要高于上面的几种方法，但是提取的DNA也还是会呈现出淡黄色，所以在后续PCR时也只有一种垫料的DNA扩增出了目的条带，这对于不同发酵程度的垫料来讲，没有针对性；而SDS-CTAB法所提取的四种发酵程度不同的垫料的DNA都具有很高的纯度，DNA溶液比较清澈透明，直接DNA电泳能得到比较单一的条带，后续的PCR也能扩增出比较亮的目的条带。
综合分析表明，试剂盒法因为没有专门针对本实验垫料的DNA提取试剂盒，所采用粪便，土壤以及淤泥试剂盒都没有达到很好的效果，而在化学法当中，单纯的SDS法和CTAB法都不能有效除去腐殖酸和杂蛋白的污染，只有SDS-CTAB结合法提取的DNA具有完整性好，纯度高，不需要纯化直接就可用于PCR扩增，有利于进行下游的分子生态学研究。
关键词：垫料微生物 DNA提取 SDS-CTAB 16SrDNA
基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项（2008ZX07425-002）；国家科技支撑项目（2008BAD96B07）；福建省发改委项目（闽发改投资[2008]762号）；福建省属公益类科研院所基本科研专项（2010R1020-1）。
作者简介：刘云浩（1988-），男，硕士研究生。研究方向：应用微 生物 ，E-mail：1988yh@gmail.com
~undefined 通讯作者：刘波（1957-），男，博士，研究员，研究方向：微 生物 生物技术与农业生物药物。E-mail：liubofz@163.com.
作者简介：刘云浩（1988-），男，硕士研究生。研究方向：应用微 生物 ，E-mail：1988yh@gmail.com
~undefined 通讯作者：刘波（1957-），男，博士，研究员，研究方向：微 生物 生物技术与农业生物药物。E-mail：liubofz@163.com.
