胞外DNA（eoDNA）的提取

质量的eoDNA更是探究结果准确性的保证。目前, 对于eoDNA的获取, 使用的方法主要有: 苯酚–氯仿 抽提法、微柱吸附法、磁珠吸附法。 Fleischhacker等[55] 比较了三种 试剂 盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit from Qiagen, NucleoSpin Kit from Macherey-Nagel, MagNA Pure isolation system from Roche Diagnostics)获取eoDNA的效率, 认为DNA富 集方法在定量检测中起到很重要的作用。Yuan等[80] 用改良苯酚–氯仿法富集eoDNA, 高效地检测到eoDNA 中的EGFR(epidermal growth factor receptor), 且其检 出率要高于微柱吸附法 试剂 盒。Chen等[81] 研究表明, 传统苯酚–氯仿法虽收集的DNA纯度不是很高, 但 是DNA的含量相对高纯度PCR模板制备试剂盒和单 细胞PCR要高得多, 是相对最有效率的提纯方法。
严子禾等[82] 比较了传统苯酚–氯仿法、微柱吸 附法试剂盒和磁珠吸附法试剂盒对血浆游离结核分 枝杆菌DNA和质粒DNA的提取效率, 得出磁珠吸附 法对血浆游离DNA的提取效率最高, 尤其适合于小 片段DNA的提取。宋小燕等[83] 通过对国产试剂盒提 取血浆DNA的方法进行改良, 提取的血浆DNA的质 量不仅能达到相关分子 生物 学 实验的要求, 而且操 作简单、耗时短、成本低。Yin等[84] 将盐析与苯酚– 氯仿法相结合并进行改进提取血浆DNA, 得到的总 DNA是微柱吸附法 试剂 盒提取方法的两倍。通过此 法得到总DNA后, 又根据胎儿DNA分子片段长度小 于孕妇自身DNA的原理, 利用纯化PCR产物的过滤 膜装置过滤提取的血浆DNA, 得到的胎儿DNA是微 柱吸附法 试剂 盒提取方法的8倍。
从妊娠妇女外周血中得到胎儿DNA主要有两 种途径, 一种是从妊娠妇女外周血中富集纯化胎儿 细胞, 另一种是从孕妇血中直接获取cffDNA。目前, 主要的提取方法是提取出母体血浆总DNA, 然后再 用特异的引物扩增来判断胎儿特异性DNA序列, 也 有依据分子大小分离得到cffDNA, 还有用肽核酸来 富集得到cffDNA序列
综上所述, 传统苯酚–氯仿抽提法, 虽操作复 杂、特异性差, 但提纯效率较好, 改良后是一种高效、 廉价的富集方法; 微柱吸附法, 操作简便、DNA纯 度相对较高、重复性好, 但成本相对较高, 而且对小 片段DNA丢失较严重; 磁珠法采用磁珠吸附, 磁场 分离的原理, 操作简便、快速、DNA纯度高, 特别适 合小片段eoDNA的富集。
eoDNA被认为是检测肿瘤组织的一种替代标 记, 然而由于eoDNA含量低、片段小, 在提取过程中 极易丢失, 特别是肿瘤特异DNA片段, 因多出现在 小片段上而在提取过程中更易丢失, 一些肿瘤的特 异基因可以在组织中检测到却不能在eoDNA中检 测到[80,85] 。此外, 在肿瘤患者体内, 肿瘤的恶化使肿 瘤微环境中正常细胞产生大量eoDNA, 而造成肿瘤相关DNA相对含量下降, 检测背景升高。还有一些 检测手段要求样品中DNA浓度必须达到一定的浓 度, 如甲基化特异性多连接依赖性探针扩增(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA)要求检测DNA必须达到 50 ng/L [86] 。而对于临床检测具有实用性的廉价分光 光度法, 现在所获取的eoDNA的浓度还远不能达到 其检测线[87] 。