实验室常用缓冲液、试剂的配制方法
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#1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)#
组份浓度:1 M Tris-HCl
配制量:1 L
配制方法:
1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。
2. 加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
4. 将溶液定容至1 L。
5. 高温高压灭菌后,室温保存。
注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
#10&timeTE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)#
组份浓度:100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA
配制量:1 L
配制方法:
1. 量取下列溶液,置于1 L烧杯中。
2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水,均匀混合。
3. 将溶液定容至1 L后,高温高压灭菌。
4. 室温保存。
#1.5 M Tris-HCl (pH8.8)#
组份浓度:1.5 M Tris-HCl
配制量:1 L
配制方法:
1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。
2. 加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。
4. 将溶液定容至1 L。
5. 高温高压灭菌后,室温保存。
注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
#3 M 醋酸钠(pH5.2)#
组份浓度:3M 醋酸钠
配制量:100ml
配制方法:
1.称量40.8g NaAc·3H2O置于100-200ml烧杯中,加入月40ml的去离子水搅拌溶解
2.加入冰醋酸调节pH值至5.2
3.加去离子水将溶液定容至100ml
4高温高压灭菌后,室温保存。
#Buffer#
组份浓度:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4
配制量:1 L
配制方法:
1. 称量下列 试剂 ,置于1 L烧杯中。
2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3. 滴加浓盐酸将pH值调节至7.4,然后加入去离子水将溶液定容至1 L。
4. 高温高压灭菌后,室温保存。
注意:上述 Buffer中无二价阳离子,如需要,可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。
#10 M 醋酸铵#
组份浓度:10 M 醋酸铵
配制量:100 ml
配制方法:
1. 称量77.1 g醋酸铵置于100~200 ml烧杯中,加入约30 ml的去离子水搅拌溶解。
2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。
3. 使用0.22 mm滤膜过滤除菌。
4. 密封瓶口于室温保存。
注意:醋酸铵受热易分解,所以不能高温高压灭菌。
#Tris-HCl平衡苯酚#
配制方法:
1. 使用原料:大多数市售液化苯酚是清亮无色的,无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色,应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚,结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物,这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此,苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要,我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
2. 操作注意:苯酚腐蚀性极强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行,与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。
3. 苯酚平衡:因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相,因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上,苯酚平衡操作方法如下:
① 液化苯酚应贮存于-20℃,此时的苯酚呈结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温,然后在68℃水浴中使苯酚充分融解。
② 加入羟基喹啉(8-Quinolinol)至终浓度0.1%。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂,同时因其呈黄色,有助于方便识别有机相。
③ 加入等体积的1 M Tris-HCl(pH8.0),使用磁力搅拌器搅拌15分钟,静置使其充分分层后,除去上层水相。
④ 重复操作步骤③。
⑤ 加入等体积的0.1 M Tris-HCl(pH8.0),使用磁力搅拌器搅拌15分钟,静置使其充分分层后,除去上层水相。
⑥ 重复操作步骤⑤,稍微残留部分上层水相。
⑦ 使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。
⑧ 将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。
苯酚/氯仿/异戊醇 (25 : 24 : 1)
配制方法:
1. 说明:从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离,而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。
2. 配制方法:将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24 : 1)混合均匀后,移入棕色玻璃瓶中4℃保存。
#10% (W/V) SDS#
组份浓度:10% (W/V)SDS
配制量:100ml
配制方法:
1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中,加入约80ml的去离子水,68℃加入溶解
2.滴加浓盐酸调节pH值至7.2
3.将溶液定容至100ml后,室温保存。
#2 N NaOH#
组份浓度:2 N NaOH
配制量:100 ml
配制方法:
1. 量取80 ml去离子水置于100~200 ml塑料烧杯中(NaOH溶解过程中大量放热,有可能使玻璃烧杯炸裂)。
2. 称取8 g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中,边加边搅拌。
3. 待NaOH完全溶解后,用去离子水将溶液体积定容至100 ml。
4. 将溶液转移至塑料容器中后,室温保存。
#2.5 N HCl#
组份浓度:2.5 N HCl
配制量:100 ml
配制方法:
1. 在78.4 ml的去离子水中加入21.6 ml的浓盐酸(11.6 N),均匀混合。
2. 室温保存。
#5 M NaCl#
组份浓度:5 M NaCl
配制量:1 L
配制方法:
1. 称取292.2 g NaCl置于1 L烧杯中,加入约800 ml的去离子水后搅拌溶解。
2. 加去离子水将溶液定容至1 L后,适量分成小份。
3. 高温高压灭菌后,4℃保存。
#20% (W/V) Glucose#
组份浓度:20% (W/V) Glucose
配制量:100 ml
配制方法:
1. 称取20 g Glucose置于100~200 ml烧杯中,加入约80 ml的去离子水后,搅拌溶解。
2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。
3. 高温高压灭菌后,4℃保存。
#Solution I(质粒提取用)#
组份浓度:25 mM Tris-HCl(pH8.0), 10 mM EDTA, 50 mM Glucose
配制量:1 L
配制方法:
1. 量取下列溶液,置于1 L烧杯中。
2. 高温高压灭菌后,4℃保存。
3. 使用前每50 ml的Solution I中加入2 ml的RNase A(20 mg/ml)。
#Solution II(质粒提取用)#
组份浓度:200mM NaOH,1%(W/V)SDS
配制量:500ml
配制方法:
1.量取下列溶液,置于500ml烧杯中
10% SD 50ml
2N NaOH50ml
2.加灭菌水定容至500ml,充分混匀
3.室温保存,此溶液保存时间最好不要超过一个月
注意:SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌
#Solution III(质粒提取用)#
组份浓度:3 M KOAc, 5 M CH3COOH
配制量:500 ml
配制方法:
1. 称量下列 试剂 ,置于500 ml烧杯中。
2. 加入300 ml去离子水后搅拌溶解。
3. 加去离子水将溶液定容至500 ml。
4. 高温高压灭菌后,4℃保存。
#0.5 M EDTA(pH8.0)#
组份浓度:0.5 M EDTA
配制量:1 L
配制方法:
1. 称取186.1 g Na2EDTA·2H2O,置于1 L烧杯中。
2. 加入约800 ml的去离子水,充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值至8.0(约20 g NaOH)。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能完全溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1 L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6. 室温保存。
#1 M DTT#
组份浓度:1 M DTT
配制量:20 ml
配制方法:
1. 称取3.09 g DTT,加入到50 ml塑料 离心管 内。
2. 加20 ml的0.01 M NaOAc(pH5.2),溶解后使用0.22 mm滤器过滤除菌。
3. 适量分成小份后,-20℃保存。
#10 mM ATP#
组份浓度:10 mM ATP
配制量:20 ml
配制方法:
1. 称取121 mg Na2ATmiddot;3H2O,加入到50 ml塑料 离心管 内。
2. 加20 ml的25 mM Tris -HCl(pH8.0),搅拌溶解。
3. 适量分成小份后,-20℃保存。
组份浓度:1 M Tris-HCl
配制量:1 L
配制方法:
1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。
2. 加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
4. 将溶液定容至1 L。
5. 高温高压灭菌后,室温保存。
注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
#10&timeTE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0)#
组份浓度:100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA
配制量:1 L
配制方法:
1. 量取下列溶液,置于1 L烧杯中。
2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水,均匀混合。
3. 将溶液定容至1 L后,高温高压灭菌。
4. 室温保存。
#1.5 M Tris-HCl (pH8.8)#
组份浓度:1.5 M Tris-HCl
配制量:1 L
配制方法:
1. 称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。
2. 加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。
4. 将溶液定容至1 L。
5. 高温高压灭菌后,室温保存。
注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
#3 M 醋酸钠(pH5.2)#
组份浓度:3M 醋酸钠
配制量:100ml
配制方法:
1.称量40.8g NaAc·3H2O置于100-200ml烧杯中,加入月40ml的去离子水搅拌溶解
2.加入冰醋酸调节pH值至5.2
3.加去离子水将溶液定容至100ml
4高温高压灭菌后,室温保存。
#Buffer#
组份浓度:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4
配制量:1 L
配制方法:
1. 称量下列 试剂 ,置于1 L烧杯中。
2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3. 滴加浓盐酸将pH值调节至7.4,然后加入去离子水将溶液定容至1 L。
4. 高温高压灭菌后,室温保存。
注意:上述 Buffer中无二价阳离子,如需要,可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。
#10 M 醋酸铵#
组份浓度:10 M 醋酸铵
配制量:100 ml
配制方法:
1. 称量77.1 g醋酸铵置于100~200 ml烧杯中,加入约30 ml的去离子水搅拌溶解。
2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。
3. 使用0.22 mm滤膜过滤除菌。
4. 密封瓶口于室温保存。
注意:醋酸铵受热易分解,所以不能高温高压灭菌。
#Tris-HCl平衡苯酚#
配制方法:
1. 使用原料:大多数市售液化苯酚是清亮无色的,无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色,应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚,结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物,这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此,苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要,我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
2. 操作注意:苯酚腐蚀性极强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行,与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。
3. 苯酚平衡:因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相,因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上,苯酚平衡操作方法如下:
① 液化苯酚应贮存于-20℃,此时的苯酚呈结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温,然后在68℃水浴中使苯酚充分融解。
② 加入羟基喹啉(8-Quinolinol)至终浓度0.1%。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂,同时因其呈黄色,有助于方便识别有机相。
③ 加入等体积的1 M Tris-HCl(pH8.0),使用磁力搅拌器搅拌15分钟,静置使其充分分层后,除去上层水相。
④ 重复操作步骤③。
⑤ 加入等体积的0.1 M Tris-HCl(pH8.0),使用磁力搅拌器搅拌15分钟,静置使其充分分层后,除去上层水相。
⑥ 重复操作步骤⑤,稍微残留部分上层水相。
⑦ 使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。
⑧ 将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。
苯酚/氯仿/异戊醇 (25 : 24 : 1)
配制方法:
1. 说明:从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离,而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。
2. 配制方法:将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24 : 1)混合均匀后,移入棕色玻璃瓶中4℃保存。
#10% (W/V) SDS#
组份浓度:10% (W/V)SDS
配制量:100ml
配制方法:
1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中,加入约80ml的去离子水,68℃加入溶解
2.滴加浓盐酸调节pH值至7.2
3.将溶液定容至100ml后,室温保存。
#2 N NaOH#
组份浓度:2 N NaOH
配制量:100 ml
配制方法:
1. 量取80 ml去离子水置于100~200 ml塑料烧杯中(NaOH溶解过程中大量放热,有可能使玻璃烧杯炸裂)。
2. 称取8 g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中,边加边搅拌。
3. 待NaOH完全溶解后,用去离子水将溶液体积定容至100 ml。
4. 将溶液转移至塑料容器中后,室温保存。
#2.5 N HCl#
组份浓度:2.5 N HCl
配制量:100 ml
配制方法:
1. 在78.4 ml的去离子水中加入21.6 ml的浓盐酸(11.6 N),均匀混合。
2. 室温保存。
#5 M NaCl#
组份浓度:5 M NaCl
配制量:1 L
配制方法:
1. 称取292.2 g NaCl置于1 L烧杯中,加入约800 ml的去离子水后搅拌溶解。
2. 加去离子水将溶液定容至1 L后,适量分成小份。
3. 高温高压灭菌后,4℃保存。
#20% (W/V) Glucose#
组份浓度:20% (W/V) Glucose
配制量:100 ml
配制方法:
1. 称取20 g Glucose置于100~200 ml烧杯中,加入约80 ml的去离子水后,搅拌溶解。
2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。
3. 高温高压灭菌后,4℃保存。
#Solution I(质粒提取用)#
组份浓度:25 mM Tris-HCl(pH8.0), 10 mM EDTA, 50 mM Glucose
配制量:1 L
配制方法:
1. 量取下列溶液,置于1 L烧杯中。
2. 高温高压灭菌后,4℃保存。
3. 使用前每50 ml的Solution I中加入2 ml的RNase A(20 mg/ml)。
#Solution II(质粒提取用)#
组份浓度:200mM NaOH,1%(W/V)SDS
配制量:500ml
配制方法:
1.量取下列溶液,置于500ml烧杯中
10% SD 50ml
2N NaOH50ml
2.加灭菌水定容至500ml,充分混匀
3.室温保存,此溶液保存时间最好不要超过一个月
注意:SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌
#Solution III(质粒提取用)#
组份浓度:3 M KOAc, 5 M CH3COOH
配制量:500 ml
配制方法:
1. 称量下列 试剂 ,置于500 ml烧杯中。
2. 加入300 ml去离子水后搅拌溶解。
3. 加去离子水将溶液定容至500 ml。
4. 高温高压灭菌后,4℃保存。
#0.5 M EDTA(pH8.0)#
组份浓度:0.5 M EDTA
配制量:1 L
配制方法:
1. 称取186.1 g Na2EDTA·2H2O,置于1 L烧杯中。
2. 加入约800 ml的去离子水,充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值至8.0(约20 g NaOH)。
注意:pH值至8.0时,EDTA才能完全溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1 L。
5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。
6. 室温保存。
#1 M DTT#
组份浓度:1 M DTT
配制量:20 ml
配制方法:
1. 称取3.09 g DTT,加入到50 ml塑料 离心管 内。
2. 加20 ml的0.01 M NaOAc(pH5.2),溶解后使用0.22 mm滤器过滤除菌。
3. 适量分成小份后,-20℃保存。
#10 mM ATP#
组份浓度:10 mM ATP
配制量:20 ml
配制方法:
1. 称取121 mg Na2ATmiddot;3H2O,加入到50 ml塑料 离心管 内。
2. 加20 ml的25 mM Tris -HCl(pH8.0),搅拌溶解。
3. 适量分成小份后,-20℃保存。