影响免疫亲和层析纯化效果的因素
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影响免疫亲和层析纯化效果的因素
多种因素影响免疫亲和层析纯化效果，其中最关键的三个因素是：抗原的初始纯度，抗原与抗体的亲和力，以及抗原抗体结合是否容易发生解离。
在免疫亲和层析技术中，抗原的初始相对浓度（即纯度）是决定最终产物纯度极为重要的因素，因为抗原-抗体的反应具有相当高的特异性，还没有任何其他一种层析技术能经过一步纯化得到如此高的纯度。然而，纯化的程度不是无限的，免疫亲和层析的纯化效果不低于1000倍，一般可达10000倍。如果所纯化的蛋白质抗原的量非常低，免疫亲和层析必须与其他方法结合，才能获得纯化产物，可以在免疫亲和层析之前或其后采用其他的纯化步骤来完成。例如，常用的方法是在进行免疫亲和层析之前先将样品通过一种或多种标准层析柱；或者将免疫亲和层析的纯化产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转印到尼龙膜上进行微量测序。
抗体对相应抗原的亲和力是免疫亲和层析法遇到的最麻烦的问题，抗体的亲和力将决定从含抗原的溶液中捕获抗原的总量，高亲和力的抗体(>108 /mol)能在lh以内完成有效地结合；而低亲和力的抗体(106 /mol)即使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。值得注意的是免疫亲和层析达到平衡所需的总时间比其他方法如免疫沉淀显著延长，因为抗体是结合到固相支持物上，这样就减慢了结合速率。由此亦可采用其他更有效的免疫化学技术来捕捉抗原，如使用多克隆抗体来识别同一抗原上的多个表位，但这种方法对大多数免疫亲和层析并不适合。正如预期的那样，通过这些方法增强抗原抗体结合的亲和力，虽然可结合较多的抗原，但是在洗脱抗原时，也会遇到很多始料不及的问题。如果最终的目的是纯化保持原来特性的蛋白，只能选择结合一个表位或一个短肽序列的抗体。只有当所需的最终产物为变性的蛋白时，才选用结合抗原分子上多个表位的抗体。
影响免疫亲和层析纯化效果的第三个因素是抗原被洗脱的相对容易程度。这完全取决于抗原-抗体相互作用的结合键的类型和数量。这虽然与抗体的亲和力有关，但亲和力并不决定抗原是否容易洗脱。用于免疫亲和层析的理想抗体是对抗原具有高亲和力，这种结合可被一种易于操作、简单而且温和的方法而逆转，例如pH值的改变。在设计免疫亲和层析的方法时，通常认为最重要的是选择抗体和洗脱条件，在不同的洗脱条件下测试不同抗体，有利于选用高亲和力与易于洗脱的抗体。
在设计免疫亲和层析的实验中，常见的错误是将低亲和力等同于容易洗脱。尽管使用某些低亲和力抗体时洗脱较为容易，但通常并非总是如此，不论高亲和力还是低亲和力抗体与抗原结合键的基本类型是相同的。例如，高亲和力和低亲和力的抗体都可通过盐桥和抗原结合，并且是疏水作用。在这两种情况下洗脱抗原都需要将这种结合键破坏。因此，选择洗脱条件时就面临相同的问题。此外，低亲和力抗体还会带来另外的问题，包括结合容量低；在连续不断从层析柱中洗脱抗原时，将会形成一个较为平坦的峰，而不是陡峭的洗脱峰。
