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PCR-SSP扩增体系的组成和准备

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1787
PCR-SSP 扩增体系的组成和准备
(一)SSP引物混合液的准备
预先准备好所有引物的混合液,其中包括除Taq多聚酶和待测基因组DNA之外的所有PCR反应成分,即:
(1) 2pmol 5’ 末端和3’末端的引物
(2) 2pmol 内参照引物(β-actin基因引物)
(3) 200umol 各种d-NTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
(4) 1 X PCR缓冲液:10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01%明胶。
(5) Ficoll 400 (终浓度为1%,V/V)
(6) 加样缓冲液(甲酚红,终浓度为0.001%,W/V)
上述引物混合液准备好后,分装至作好标记的PCR扩增管中,每扩增管中上述引物混合液的体积为36ul,反应体积的调整使用双蒸水,不要使用TE,EDTA 可抑制Taq多聚酶的活性。置于-20C保存,临用时取出。
(二)DNA/Taq多聚酶混合液的准备
(1) 计算扩增所需管数,每对SSP引物须用一只扩增管单独扩增;
(2) 计算Taq多聚酶用量,每扩增管需Taq多聚酶0.5~0.8U;
(3) 计算基因组DNA总量,每扩增管需60ng的基因组DNA;
(4) 将基因组DNA和Taq多聚酶在一定量的稀释液中混匀,即为DNA/Taq多聚酶混合液,稀释液为上述1 X PCR缓冲液(注意 :每扩增管所需的基因组DNA和Taq多聚酶的量应包括在4ul体积的DNA/Taq多聚酶混合液中);
(5) 用加样器将基因组DNA与Taq多聚酶混匀,注意混匀时避免形成气泡,否则容易导致气溶胶状DNA的形成,造成污染。
(三)PCR-SSP扩增体系的组成
(1) 取出装有SSP引物混合液的扩增管,加入4ul的DNA/Taq多聚酶混合液,注意用加样器将DNA/Taq多聚酶混合液加入至引物混合液的底部,每扩增管的反应体积为40ul(注意 :基因组DNA应完全稀释和混匀,吸取或接触不同扩增管的液体后,注意更换吸头;使用的吸头最好带滤膜);
(2) 每个扩增管加20ul矿物油,防止PCR扩增时水分蒸发。
PCR-SSP 扩增
按下述扩增条件进行PCR扩增〔适合Perkin-Elmer9600或PTC1000(MJ Research Inc)PCR扩增仪,其他型号的PCR扩增仪也可以参考上述扩增条件〕
94℃预变性 5分钟
94℃变性 20秒
65℃退火和延伸 60秒
循环次数 30次
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