PCR-SSP结果分析
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PCR-SSP
结果分析
采用SSP进行PCR扩增后，相应的PCR产物是否出现，是HLA分型结果的判断的依据，相应SSP扩增产物出现，表示基因组中存在与特异性引物（即SSP）互补结合的DNA序列，即样本为该SSP结合的HLA基因阳性。当某种SSP引物的扩增管中未出现相应的PCR产物时，应注意观察内参照引物是否出现PCR产物。如果该扩增管的内参照引物出现PCR产物，而无相应SSP扩增产物，说明样本为该SSP特异性扩增的HLA基因阴性；如果该扩增管中未出现内参照引物的扩增产物，则意味着PCR扩增出现问题。
【注意事项和经验总结】
（1） PCR-SSP技术的原理是基于引物序列与基因组（模版）DNA的严格互补结合，因此使用的Taq多聚酶应该无3’-5’外切酶活性，否则外切酶的作用可能修正错配的引物-模版复合物，导致错配延伸，出现假阳性结果。
（2） 由于每一种HLA等位基因均需要一对SSP扩增，因此对每一个样本进行HLA分型时，均需要进行多个扩增，扩增的数目取决于检测HLA等位基因的数目。采用扩增管进行HLA分型时特别注意每一扩增管中SSP的特异性，应该作好标记，并有规律地排列、放置和加样，避免出现混乱，使分型结果错误。除使用微量扩增管之外，还可以使用96孔的PCR扩增板，较扩增管方便。
（3） 由于PCR-SSP技术对污染的DNA较为敏感，注意加样时使用带有滤膜的吸头；在吸取含有不同SSP和基因组DNA的溶液后，一定要更换吸头；用加样器吸取或混匀溶液时避免产生气泡，产生气溶胶状DNA，造成污染。
（4） HLA-I类基因分型时，需要较长的基因组DNA链（约250kb）作为模版，因为HLA-I类基因SSP进行互补结合的DNA序列位于第1～4外显子之间。在基因组DNA提取时应注意。
（5） 上述介绍的PCR-SSP分型方法的条件应根据实际情况（使用的SSP、Taq多聚酶和PCR扩增仪等）作适当的调整。
（6） 凝胶电泳时使用的DNA染料（溴化乙锭）是致突变剂，操作时应戴手套，并注意在规定的范围内操作，废液或废物应妥善处理。
