PCR-SSP结果分析
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PCR-SSP
结果分析
采用SSP进行PCR扩增后,相应的PCR产物是否出现,是HLA分型结果的判断的依据,相应SSP扩增产物出现,表示基因组中存在与特异性引物(即SSP)互补结合的DNA序列,即样本为该SSP结合的HLA基因阳性。当某种SSP引物的扩增管中未出现相应的PCR产物时,应注意观察内参照引物是否出现PCR产物。如果该扩增管的内参照引物出现PCR产物,而无相应SSP扩增产物,说明样本为该SSP特异性扩增的HLA基因阴性;如果该扩增管中未出现内参照引物的扩增产物,则意味着PCR扩增出现问题。
【注意事项和经验总结】
(1) PCR-SSP技术的原理是基于引物序列与基因组(模版)DNA的严格互补结合,因此使用的Taq多聚酶应该无3’-5’外切酶活性,否则外切酶的作用可能修正错配的引物-模版复合物,导致错配延伸,出现假阳性结果。
(2) 由于每一种HLA等位基因均需要一对SSP扩增,因此对每一个样本进行HLA分型时,均需要进行多个扩增,扩增的数目取决于检测HLA等位基因的数目。采用扩增管进行HLA分型时特别注意每一扩增管中SSP的特异性,应该作好标记,并有规律地排列、放置和加样,避免出现混乱,使分型结果错误。除使用微量扩增管之外,还可以使用96孔的PCR扩增板,较扩增管方便。
(3) 由于PCR-SSP技术对污染的DNA较为敏感,注意加样时使用带有滤膜的吸头;在吸取含有不同SSP和基因组DNA的溶液后,一定要更换吸头;用加样器吸取或混匀溶液时避免产生气泡,产生气溶胶状DNA,造成污染。
(4) HLA-I类基因分型时,需要较长的基因组DNA链(约250kb)作为模版,因为HLA-I类基因SSP进行互补结合的DNA序列位于第1~4外显子之间。在基因组DNA提取时应注意。
(5) 上述介绍的PCR-SSP分型方法的条件应根据实际情况(使用的SSP、Taq多聚酶和PCR扩增仪等)作适当的调整。
(6) 凝胶电泳时使用的DNA染料(溴化乙锭)是致突变剂,操作时应戴手套,并注意在规定的范围内操作,废液或废物应妥善处理。