实用DNA突变技术

互联网2010-12-02

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实用 DNA 突变技术

(一)PCR法扩增启动子5’端系列缺失突变体

采用PCR 方法从基因组中扩增目的基因的全长启动子，在所扩增的片段两端分别引入限制性内切酶位点，以用于构建pGL3 basic报告基因表达质粒载体。同样采用PCR方法，以目的基因全长启动子报告基因表达质粒为模板分别扩增目的基因启动子5’端系列缺失突变体，这样就可以构建5’端系列缺失目的基因的缺失突变体。

连续PCR引入突变位

(二)通过连续PCR引入点突变

所设计的寡核苷酸引物在所扩增的目的片段一端引入点突变，PCR扩增后获得两条PCR产物，先将两条均含有突变的片段退火形成新的模板，然后由互补的引物引导延伸合成含有突变位点的全长片段。

对于单点突变，Stratagene公司的QuikChangeSite―DirectedMutagenesisKit是不错的选择。通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规大肠杆菌中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物(正、反向)和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝)。正、反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎(Dpn I识别序列为甲基化的GATC，GATC在／L乎各种质粒中都会出现，而且不止一次)，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙地利用甲基化的模板质粒对Dpn I敏感，而合成的突变质粒对Dpn I酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外，由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene公司的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8kb的质粒。后来推出的QuikChangeXLSite―DireetedMutagenesisKit则是针对大于8kL的质粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞(XLl0―Gold)，使得较大的质粒的定点突变也一样简单。