酵母双杂交实验技币和其他双成分系统
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酵母双杂交实验技币和其他双成分系统
酵母 双杂交系统是以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础。真核细胞转录激活因子的结构都基本相似，由一个DNA结合结构域(BD)和一个转录激活结构域(AD)组成，如酵母蛋白GAL4，这两个结构域相互独立但功能上有相互依赖，它们之间只有通过某种方式结合在一起才有完整的转录激活因子活性。根据这一特点建立了酵母双杂交系统。具体实验步骤如下。
1．第一阶段(诱饵―LexA融合蛋白的鉴定)
1)诱饵―LexA融合蛋白的构建
(1)将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列，形成的质粒作为pBait。
(2)采用LexA融合基因和lexAop―lacZ报告质粒的组合，建立一系列EGY48lexAop―LEU2选择的转化酵母菌。
(3)将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上，制备转化子的母板。
2)活化和抑制活性的鉴定(X―gal和Leu2表型的分析)
3)检测诱饵蛋白质表达
(1)在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用。
(2)对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子，还包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子。
(3)为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含LexA融合的诱饵的酵母裂解液。
2．第二阶段(筛选一个相互作用子)
1)转化文库：挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop―lacZ报告子的酵母菌落，接种于CM(Glu)―Ura―His液体培养基中培养。
2)初级转化子的收获和富集：通过摇动法或刮擦法收获文库。
3)相互作用蛋白的筛选
(1)应用p―半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求初步检测可能发生相互作用的蛋白。
(2)阳性相互作用的二次确定：分离阳性质粒并转化至大肠杆菌中。通过对含有相同插入片段的阳性克隆制备重复样品来进行限制性酶切分析，以确定是否重复分离到了小量的cDNA。
(3)阳性相互作用的第三次确定：重复表型和特异性检测。
(4)应用融合蛋白进行蛋白质印迹来检测蛋白质―蛋白质相互作用。
