使用显微镜通过形态学检测细胞凋亡
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使用显微镜通过形态学检测细胞凋亡
细胞凋亡的检测有定性或定量两类方法。定性可以通过形态学观察，包括光镜、电镜和荧光显微镜等，也可以通过琼脂糖电泳来检测特征性DNA梯形条带。定量研究的首选方法为流式细胞仪。原位末端标记法则既可用于定性，又可用于半定量。此外，相比荧光显微镜，激光共聚焦技术提供了更高的分辨率，并可以作一定程度的断层扫描，利用相应的软件可以把图像压缩成三维立体图形。荧光显微镜和(或)激光共聚焦与定时摄影技术相配合，可以记录凋亡过程的动态变化。
如前所述，早期的凋亡主要依赖光镜和电镜进行形态学研究。光镜主要是对HE染色的切片进行观察，在镜下可见染色体核浓缩等。但因其提供的信息有限，现已不常用。利用相差显微镜，在高倍下观察可见凋亡细胞 膜的泡化(bledding)及细胞膜和核膜的折光性改变，但这些改变不是普遍现象。相对而言，电镜的分辨率高，可以显示细胞各个亚器官的变化。荧光显微镜既可定位，又可做定量分析，因而更常用。
(一)透射电子显微镜
电镜分为透射电镜和扫描电镜，观察细胞一般使用透射电镜。透射电镜的优势是分辨率高(o．2nm)，放大倍数为几万至几十万倍。在电镜下，细胞内器官诸如线粒体、溶酶体、核糖体和内质网等的结构都一清二楚。观察细胞凋亡时不仅可以检测凋亡小体，同时也能观察超微结构的变化。电镜一般都由专人操作，在此仅介绍样品的制备方法。
用于电镜的样品既可以是组织也可以是细胞，取材的要点是快速和新鲜。固定液一般用2％的锇酸溶液，用时在冰浴中预冷。切取的组织块应0．5-1cm3，切下后迅速置于固定液中。对悬浮细胞可以离心收集(1 000-1 500r／min，5min)，弃培养液后迅速加入锇酸固定液，于冰浴中固定。对贴壁细胞的处理则有两种：既可以用常规消化离心方法收集细胞，然后固定；也可以在弃去培养液后直接在培养皿中加入固定液，至少固定30min，然后刮取细胞，离心收集。这样做的好处是能保留细胞最原始的状态，排除了胰酶消化和离心对细胞的影响。然而锇酸的固定会使细胞脱水，无法用常规的离心法收集细胞(细胞会保持悬浮)，但可以用过滤离心的方法收集。
电镜下可见早期凋亡细胞的核染色体发生边缘化，在细胞核膜周边聚集形成新月体形；稍后由于染色体发生固缩，电子密度增强；核碎裂时则可在胞质中发现多个电子密度增强的核碎片。凋亡细胞体积变小，但细胞器可以保持完好。线粒体完整，但可以轻度肿胀。细胞膜完整，表面微绒毛和尾足减少或消失。细胞凋亡的晚期，可见膜包裹的凋亡小体。
(二)荧光显微镜和激光共聚焦技术
荧光素是一种染料，在一定波长的激发光(excitation)激发下，可以发射(emission)另一波长的光，并被荧光显微镜所接收。某些荧光素可以和组织或细胞内特定的结构结合，因而可以用来检测其含量、结构和分布的变化，并推测细胞的功能状态。被荧光素标记的组织／细胞切片可以在荧光显微镜或利用激光共聚焦技术进行分析。与荧光显微镜相比，激光共聚焦技术可以对细胞或组织进行断层扫描，分辨率更高。同时，还可以通过计算机将断层扫描的图像合成三维结构，提供更全面的技术资料。荧光显微镜与摄像技术联用还可以定时记录被观察样品的动态变化过程。将标记的细胞被处理成细胞悬液，还可以用流式细胞仪进行检测。
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染 料
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用 途
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激发／发射波长(nm)
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荧光颜色
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DAPI
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标记DNA
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359／461
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亮蓝色
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Hochest-33342
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标记DNA
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346／460
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蓝色
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Hochest-33258
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标记DNA
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346／460
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蓝色
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碘化丙啶(PI)
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标记DNA(去垢剂预处理增加细胞通透性)
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536／617
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红色
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罗丹明123
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特异性染色线粒体
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488／530
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亮绿色
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DiOC2(3)
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线粒体膜电位差
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482／497
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绿色或红色
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JC-1
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线粒体膜电位差
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488／低膜电位525，
高膜电位590
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绿色
红色
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FLICA
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caspase
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取决于所标记的荧光素
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红色或绿色
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注：FLICA 表示capase荧光染料抑制物(fluorchrOme inhibitOr of caspases)
