噬菌体表面展示方式
互联网
1710
噬菌体表面展示方式
目前在噬菌体肽库技术中，主要用于表面展示肽库的方式有两种：pⅢ蛋白展示方式和pⅧ蛋白展示方式。展示系统又可分为噬菌体表面展示系统和噬菌粒(phagmid)表面展示系统。
噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可展示外源多肽或蛋白质，在基因工程操作上基本相同：在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有一个可以插入外源基因片段的克隆位点，插入的外源基因编码的蛋白与pⅢ和pⅧ以融合蛋白的形式表达并分泌至胞间质内，当宿主蛋白酶切除信号肽后，融合蛋白则成熟组装并包裹病毒DNA分子形成病毒粒子的外壳。
1．pⅢ蛋白展示方式
丝状噬菌体的pⅢ蛋白是一种次要外壳蛋白，由基因gⅢ编码，位于丝状噬菌体的头部，在每个噬菌体颗粒表面仅有3～5个拷贝，具有识别和吸附大肠杆菌性菌毛的功能，是噬菌体感染宿主必不可少的部分。
pⅢ蛋白是噬菌体外壳蛋白中相对分子质量最大的蛋白质，pⅢ前体由424个氨基酸残基组成，相对分子质量为44 651X10‘，其中信号肽由18个氨基酸残基组成(MKKLLFAIPLVVPFYSHS)，引导pⅢ至细菌胞间质后即被细菌蛋白酶水解除去。成熟的pⅢ蛋白由406个氨基酸组成，相对分子质量为42 579X103，由3个功能区组成：①穿膜区。在成熟的pⅢ蛋白中是N端最前面的区域，伸出噬菌体的表面，可以与大肠杆菌的外膜蛋白TolA结合并介导噬菌体DNA进人大肠杆菌细胞内。这个区域也是插入外源基因的理想位置，允许插入较大的基因片段(多达数百个氨基酸残基)，而不影响pⅢ蛋白识别和结合F性菌毛的功能。②受体结合区，是噬菌体与大肠杆菌性菌毛顶端结合的区域。噬菌体通过此区域可以特异地吸附在雄性大肠杆菌的F性菌毛上，从而感染大肠杆菌。③疏水结合区。位于pⅢ的C端，病毒组装前负责将pⅢ黏附在细菌内膜上，组装后这段氨基酸序列嵌在噬菌体颗粒的外壳上。在SDS―PAGE电泳时，pⅢ常常会出现相对分子质量为60000～65 000的条带，这可能是由于pⅢ蛋白的结构域之间存在着富含甘氨酸的间隔区有关。
2．pⅧ蛋白展示方式
pⅧ蛋白是丝状噬菌体颗粒的主要外壳蛋白，由基因Ⅷ编码，在每个噬菌体颗粒上有2 700―3 000个pⅧ蛋白分子。这些pⅧ蛋白分子呈螺旋对称排列组成管状结构，包裹在单链DNA外面。
pⅧ前体由?3个氨基酸残基组成，其中信号肽为23个氨基酸残基，其引导出细胞后被引导肽酶切除。而成熟的pⅧ蛋白由基因Ⅷ编码，含50个氨基酸，相对分子质量为5 200。根据构成外壳的功能可分为4个区：①N端1―5氨基酸残基区域，含酸性氨基酸，为可活动的、外露在噬菌体颗粒蛋白外表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置；②6―24氨基酸残基区域占据噬菌体表面的大部分；③25―35氨基酸残基区域高度疏水性，使维持病毒颗粒现状的主要力量；④C端35―50氨基酸残基区域，构成噬菌体外壳完整的内壁，其C末端富含碱性氨基酸，与单链环状DNA相结合。
在其表达的pⅧ蛋白所在N端的位置插入外源基因时，在组装出来的噬菌体颗粒上便能携带有数以千计的外源多肽分子。但pⅧ用于噬菌体展示系统时，插入的多肽如超过9个氨基酸，则噬菌体的装配会完全受阻，一般情况pⅧ最多插入6个氨基酸的短肽。而在噬菌粒展示系统中，利用PⅧ融合蛋白可以表达较大的外源基因。另外，也可以通过在噬菌体中除含有插入有外源肽的pⅧ外，再加人野生型的夕Ⅷ基因，并控制野生型和融合外源多肽pⅧ的比例(一般控制在10％左右，这样平均每个噬菌体也有约200多个肽)。利用这一表达系统，一般只能筛选出低亲和力配体。
|
外源多肽与pⅧ蛋白融合时，由于其拷贝数高(2 700个)，将这种载体作为多肽表位用于免疫原时可产生良好的免疫应答，具有反应优势，故在疫苗开发上具有潜在的应用价值。
用于展示外原肽的pⅢ和户Ⅷ基因在噬菌体的单链DNA基因组中都只有一个拷贝，当这2个基因中插入了外源基因后，则所有噬菌体外壳的pⅢ或pⅧ蛋白上都带上了外源肽，当外源肽太大时则会影响衣壳蛋白的正常功能。对pⅢ蛋白来说，则不能识别大肠杆菌的性菌毛，使噬菌体不能感染和增殖；对pⅧ蛋白来说，则不能组装成病毒颗粒。
一般可以通过在基因组中除了有一个插入外源基因的户Ⅲ和户Ⅷ基因外，再引入一个野生型基因。这样在噬菌体外壳上既有含融合表达外源肽的蛋白，也有野生型的蛋白质，从而不影响噬菌体的识别感染和组装功能。这种展示方式为图33型或88型。
|
噬菌体表面展示方式
|
