TFPI的基因工程
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TFPI
的基因工程
下面以我们实验室研制的TFPI为例，具体描述基因工程的步骤和方法。
(一)获取目的基因
获取目的基因的方法很多。对于大多数已知基因，借助反转录酶，以mRNA为模板，进行酶促合成相应的cDNA，是获得真核细胞基因最主要和最常用的方法。TFPI基因可用此法获得。
1．搜索t-PAmRNA序列
(1)登陆美国国家生物技术信息中心(national centerfor biotechnology information，NCBl)网站http：//www．ncbi．nlm．nih．gov，在Search栏中键人nucleotide，在For栏中键人humanTFPImRNA，点击Go。
(2)网页上会出现许多搜索结果，选择NM-006287 Homo sapiens tissue hctor pathway inhibitor(lipoprotein-associated coagulation inhibitor)(TFPI)，transcript variantl，mRNA，即可得到TFPImRNA全长序列。
2．提取人胎盘组织总RNA
TFPI在胎盘组织中有丰富的表达，因此可以从胎盘组织中获得TFPI mRNA，利用TRIZOL法可以从新鲜胎盘组织中获得其总RNA。
3．RT-PCR获取TFPI基因
在反转录酶的作用下，采用oligo(dT)引物，以胎盘总RNA为模板，合成互补单链cDNA，形成DNA-RNA杂合分子。以反转录产物为模板，加入设计好的一对引物(上、下游引物中分别引入EcoR工和BamHI限制性内切酶位点)、Pfu、dNTP和缓冲液后，PCR扩增TFPI基因。
(二)TFPI基因的体外重组与测序
以EcoRI和BamHI双酶切扩增出的TFPI基因和pGEM-3Zf(-)质粒，在T4DNA连接酶的作用下，将TFPI基因与pGEM-3Zf(-)质粒重组获得pGEM-3Zf(-)-TFPI克隆质粒，转化大肠杆菌DH5α，涂LBA平板，挑阳性克隆。
为了保证所获基因的准确性，必须对其进行DNA序列测定。现有许多生物技术公司能够提供测序服务，其快捷、方便，且价格合理，为大多数实验室所采用。
(三)表达载体的构建与转化
以克隆质粒pGEM-3Zf(-)-TFPI为模板通过PCR扩增TFPI基因，其中引物在设计中引入了Nco工和Not工限制性内切酶位点。应用NcoI和NotI双酶切TFPI基因片段和表达载体pET-28a(+)，并用T4DNA连接酶将酶切产物进行连接，构建表达质粒pET-28a(+)-TFPI。将连接产物直接转化感受态大肠杆菌DH5c~，涂布于LBK平板，挑单克隆放大培养，并抽质粒进行双酶切检测及测序分析，筛选出重组的阳性克隆。
(四)TFPI基因N端密码子优化
原核表达系统与真核表达系在密码子选用的偏好性方面的差异常常会影响外源基因在宿主菌中的表达。野生型人TFPI基因直接转入宿主菌几乎没有表达，通过PCR法将N端密码子同意突变成大肠杆菌所偏好的密码子后，TFPI在宿主菌中获得较高表达。
(五)在大肠杆菌中表达TFPI
用表达质粒pET-28a(+)-TFPI转化低温CaCl2处理过的大肠杆菌BL21(Ⅲ)，即感受态细菌，获得TFPI的表达菌。挑单克隆菌落接种于LBK培养液中，逐级放大培养至OD600
＝1．2，加IPTG诱导蛋白质的表达。
(六)纯化与复性
TFPI分子结构复杂，含有9对二硫键，原核表达系统不能够完成其翻译后的加工折叠过程。蛋白质在表达后以包涵体的非活性形式存在于胞内，因此蛋白质纯化与复性成为TFPI基因工程的关键。表达结束后，离心收集细菌，再超声破胞获得包涵体。包涵体经过洗涤后，再经溶解和磺化，通过阴离子交换层析进行初次纯化。将纯化得到的蛋白质复性，再用阳离子交换层析进行二次纯化。最后，透析脱盐，冻干保存。
(七)活性鉴定
采用稀释凝血酶原时间法(dilute prothrombin time，dPT)测定TFPI的抗凝活性。用生理盐水将凝血活酶标准溶液按一定倍数稀释，置37~C预热。取100ul正常人混合血浆，加100ul稀释过的凝血活酶溶液，再加10ul不同浓度的蛋白质溶液(以生理盐水作对照)，37C孵育1min，最后加10ul 250mmol/LCaCl2
溶液，并启动计时。观察血浆凝固时间在加入蛋白质溶液时较加人生理盐水时的延长情况及其与蛋白质浓度的关系，可以确定TFPI的抗凝活性。亦可用发色底物法观察对FXa产生的抑制作用来鉴定TFPI的活性。
