TFPI的蛋白质工程
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1955
TFPI
的蛋白质工程
应用蛋白质
工程改造TFPI，主要目的是减少其在肝脏的摄取，从而延长半衰期，降低用药剂量和减少给药次数。
TFPI1-161
是TFPI的缺失突变体，主要包括前两个Kunitz结构域及N端。该突变体由于缺少K3和C端，半衰期明显延长，但同时其抗凝活性不及野生型，而且丧失了抗炎等非抗凝功能。如何尽最大可能地保全TFPI结构和功能，同时延长其半衰期，是TFPI的蛋白质工程的关键。
TFPI在体内主要通过肝细胞膜表面受体LRP介导进入细胞而被代谢清除。LRP是一种由相对分子质量为515 000和85 000两个亚基组成的巨型细胞膜糖蛋白，属低密度脂蛋白受体家族成员，能够介导多种血浆蛋白在肝细胞内的分解代谢。LRP的胞外区，即相对分子质量为515 000亚基，由4个串联的配体结合结构域组成，分别称之为clusters I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。每个配体结合结构域又分别由一定数目的LDL受体A型亚结构域(为A型半胱氨酸重复序列)组成。TFPI通过K3和C末端与LRP分子的dustersⅡ和clustersⅣ结合，其中clustersⅡ的C3―C7亚结构域(即LDLRA3～LDLRA7)为配体结合所必需。减弱TFPI与LRP分子间作用力，可以减少TFPI在肝脏的代谢。
从美国国家生物技术信息中心的蛋白质结构数据库获取TFPI的K3结构域和LRP的C3亚结构域的空间结构解析数据，以此为基础，在SGI 02计算机工作站上，应用InsightⅡ软件包进行K3+C末端的同源模建，并将其与LRP的C3亚结构域进行分子对接，搜索K3+C末端分子中距离分子间相互作用面最近的极性氨基酸残基。结果发现TFPI的K241、K254、K260和K261氨基酸残基在与LRP的分子间相互作用中发挥重要作用，其中K254距离LRP分子最近。
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TFPI和LRP之间的分子对接 |
TFPI―Mutl与LRP分子对接 |
TFPI―Mut4与LRP分子间对接 |
将Lys254单一位点或将Lys241、254、260、261四个位点突变为Ala设计分子TFPI―Mutl和TFPI―Mut4．然后通过计算机进行分子比对。结果显示TFPI及其突变体的第190～230位残基空间构象保守，将其相对固定后，由于突变体的C末端极性发生一定变化，导致其空间构象发生了明显变化，表现为以TFPI、TFPI―Mutl、TFPI―Mut4顺序呈一定程度的顺时针旋转。对于LRP，配体受体结合时的相互作用、契合效应对其空间构象影响甚微。这说明经过这些位点的突变可以导致配体―受体复合物空间结构的变化。结果显示，TFPI、TFPI―Mutl、TFPI―Mut4与LRP的对接复合物的相对吉布斯自由能分别为-293．51 kcal/mol -242．72kcal/mol和-230．56 kca/mol，表明其分子间作用力呈显著下降趋势。
在计算机模拟和蛋白质分子设计的基础上，以野生型TFPI基因为模板，用PCR方法引入突变，构建表达质粒pET―28a(+)―TFPI―Mutl和pET―28a(+)―TFPI―Mut4。然后参照野生型TFPI的基因表达、蛋白质复性及纯化方式，用大肠杆菌制备重组的TFPI―Mutl和TFPI―Mut4。试验证实TFPI―Mutl和TFPI―Mut4保持了与TFPI基本相当的抗凝活性，而且半衰期较TFPl分别延长1．62和4．22倍。
