原位杂交组织化学杂交反应
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原位杂交组织化学杂交反应
杂交反应是指用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。杂交液的成分与预杂交液基本相同，所不同的只是加入标记的核酸探针。
杂交前的准备只是为杂交成功奠定基础．要获得满意的实验结果，在杂交
反应的实验过程中还必须注意以下环节。
(一)双链DNA探针和靶DNA变性
进行杂交反应时．探针和靶核酸必须均是单链，两者方能结合。如果探针和靶核酸均为双链或二者中有一者是双链。必须通过变性使其变为单链。一般通过加热变性。变性温度为95C，5～15分钟。探针和(或)靶核酸一旦变性，则需立即进行杂交反应，否则解链的核酸又会重新复性。如果用单链探针检测靶RNA，一般不需要变性。有时单链探针较长，可能会在局部形成双链，这时也同样可通过加热处理使局部双链解开以利于探针和靶核酸之间的结合。
微波炉处理也可使双链DNA探针和靶DNA变性。此法不仅能使双链探针和靶核酸有效地变性，而且还能使杂交信号增加。这可能是由于微波辐射引起基质蛋白质变性，使靶核酸暴露，也可能是微波辐射对靶核酸构型产生直接影响，从而提高杂交效率。
(二)杂交液
杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。杂交液中含较高浓度的钠离子可使杂交率增加，还可降低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm值降低，故杂交液中加入适量的甲酰胺可避免因杂交温度过高而引起的细胞形态结构的破坏以及标本脱落。硫酸葡聚糖能与水结合?从而减少杂交液的有效容积．提高探针有效浓度。以达到提高杂交率的目的。在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，均为阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合以降低背景。当杂交液pH；一9时，杂交体的形成不受pH变化的影响，常用的杂交缓冲液的pH为6．5～7．5，含20―50mmol／L磷酸盐。
(三)探针长度
一般用于原位杂交的探针最佳长度应在30―100bp之间。探针短，易于进入细胞。杂交率高。杂交时间短。200～500bp的探针仍可使用，如超过500bp的探针最好在杂交前用碱或水解酶进行水解。使其变成短片段，达到实验所需求的碱基数。
(四)探针浓度
探针浓度的高低将影响杂交反应的速度。探针浓度低?杂交反应进行得缓慢，反之则进行得快。在原位杂交反应中，探针浓度远比组织中靶核酸浓度要高。最适宜的探针浓度应能获得最强的杂交信号和最低的背景。探针在不同组织上，或在用不同方法制备的标本上弥散和穿透情况不同，因而所需要的最适宜浓度可能也有差别。最适宜的探针浓度要通过预实验确定，一般为0．5～5.0ug／ml，通常建议放射性核素探针浓度为0．5ug／ml，非放射性探针为2ug／ml。此外，杂交液的量也要适当，一般以每张切片10～20ul为宜。杂交液过多不仅造成浪费，而且过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反而导致高背景染色等不良反应。
(五)杂交温度和时间
杂交温度应低于杂交体的熔解或解链温度(Tm)20―30℃，大约在30～60℃之间，因为在上述温度条件下进行杂交反应，杂交率最高。在实际操作中，杂交温度的选择是：当杂交液中的甲酰胺浓度为50％，盐浓度为0．75mol／L时，DNA探针的杂交温度为42℃左右，RNA探针杂交温度为50～55℃，寡核苷酸探针的杂交温度为37℃左右。在实验中需要根据具体情况摸索最佳杂交温度。
杂交反应时间可能随探针浓度的增加而缩短，但在一个相当大的浓度范围内，杂交反应在4―6小时内完成。在实际操作中，一般将杂交时间定为16～20小时，或为了方便，将杂交液和标本孵育过夜。然而，杂交反应时间不要超过24小时，反应时间过长，形成的杂交体会解链，杂交信号反而会减弱。
(六)杂交严格度
杂交体双链间碱基对的相配程度，可影响杂交体的稳定性，错配的杂交体稳定性较正确配对的杂交体差。杂交严格度(hybridization stringency)表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度，或是指决定探针是否能与含不相配碱基对的核酸序列结合而形成杂交体的条件。在高严格度条件下，只有碱基对完全互补的杂交体稳定，而在低严格度条件下，碱基并不完全配对的杂交体也可形成。影响严格度的因素有甲酰胺浓度、杂交温度和离子强度，因此可通过控制这些因素来减少非特异性杂交体形成，提高杂交特异性。在低甲酰胺浓度、高离子强度和低杂交温度条件下，严格度低，反之严格度就高。严格度愈高，杂交反应特异性愈强，但敏感性愈低；反之，特异性愈差，而敏感性愈高。
杂交严格度可在杂交反应及杂交后洗涤过程中调节。杂交反应在低严格度条件下进行，以保证探针与组织标本上靶核酸之间最大限度地结合，而杂交后冲洗则在高严格度条件下进行，以仅保存碱基对完全互补的杂交体，而含不相配碱基对的杂交体由于在高严格度条件下不稳定而被洗去。
此外，在杂交时，将杂交液滴于组织切片后，应放置硅化的盖玻片，防止孵育过程中高温导致杂交液的蒸发。盖玻片自身的重量能与有限的杂交液吸附而达到覆盖和防止蒸发的作用，必要时可在盖玻片四周用橡皮泥封固盖玻片。硅化的盖玻片优点是清洁光滑无杂质，不会产生气泡和不影响组织切片与杂交液接触。在孵育时间较长时，为了保证杂交所需的湿润环境，可将盖有硅化盖玻片的载玻片在进行杂交时放在盛有少量标准枸橼酸盐(standard saline citrate，SSC)溶液的密封硬塑料盒中进行孵育。
