丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
丁香通
点赞
收藏
wx-share
分享

双重和多重原位杂交技术

互联网

2403
双重和多重原位杂交技术
 
    为了在同一标本上或同一细胞内同时检测是否存在两种或两种以上的靶核酸序列。可应用双重或多重原位杂交技术.即以两种或多种标记探针与靶核酸杂交。然后利用不同的检测手段分别显示各种靶核酸的存在和分布。该技术与免疫组织化学技术中的双重或多重标记相似,除了探针本身的特异性外,对结果的干扰主要来自标记物及检测试剂的互相影响。
 
    (一)放射性核素和非放射性标记探针的双重标记原位杂交
    非放射性标记原位杂交技术的兴起和发展,为双重标记原位杂交提供了有效的技术途径。在将放射性核素和非放射性物质标记的两种探针结合进行的双重标记原位杂交技术中,常用的放射性核素标记物为35 S,常用的非放射性标记物为生物素和地高辛。该双重原位杂交技术可分为一步法和二步法两种。在一步法中,原位杂交反应用两种探针的混合物一次完成,显示杂交信号时,先用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与杂交体上的生物素结合,并用硝基四氮唑(NBT)和5―溴―4―氯―3―吲哚―磷酸盐(BCIP)作为底物显示杂交体上的碱性磷酸酶(或用ABC法显示杂交体上的生物素)或以碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合,并用NBT和BCIP显示碱性磷酸酶,标本脱水干燥后再进行放射自显影处理以显示另一靶核酸。一步法的优点是杂交反应一次完成,操作流程较短,同一细胞内的两种信号容易分辨;缺点是放射自显影的阳性信号要比单标时明显减少,碱性磷酸酶或ABC的阳性反应产物有可能会引起核乳胶的化学 显影。在二步法中,先后使用不同的探针进行两次杂交反应,一般先用35 S标记探针进行原位杂交,放射自显影显示第一种杂交体后再用生物素或地高辛标记的探针进行第二次原位杂交,按生物素―亲和素―碱性磷酸酶法(或ABC法)或地高辛―抗地高辛抗体―碱性磷酸酶法显示第二种杂交体。二步法的杂交信号在镜下明显可辨。用放射性核素标记探针进行第一次原位杂交的整个操作顺序,包括放射自显影的显影定影过程,不会改变mRNA的结构,也不会影响第二次杂交反应时靶核酸对探针的可及性。二步法的整个操作流程要比一步法长,但它没有一步法中存在的放射性标记信号的丢失,以及碱性磷酸酶(或ABC)阳性反应产物可能引起乳胶化学显影的弊端。
 
    (二)非放射性标记探针的双重标记原位杂交
    如果用不同的标记物标记不同的核酸探针,只要互相不影响各自的杂交反应,检测系统也不相互干扰,杂交信号易于分辨,原则上均能用于双重或多重标记原位杂交。应用非放射性标记探针的双重标记原位杂交。可克服放射性核素标记探针的分辨率低、时间长以及放射性污染等缺点。
    1.应用生物素和地高辛标记探针的双重标记原位杂交  应用生物素和地高辛分别标记的两种探针进行双重标记原位杂交时,杂交反应可用含两种标记探针的杂交液一次进行。因为生物素标记探针可用辣根过氧化物酶标记的亲和素检测(以3―氨基―9―乙基―卡巴唑为底物,阳性反应产物为红色),而地高辛标记的探针用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体来检测(反应产物为蓝色),两个检测系统互相无干扰,所以,标记的亲和素和抗地高辛抗体也可混合在一起一次孵育。但两种酶的呈色反应需要的pH条件相同,故呈色反应需分先后两次进行。
    2.双重荧光标记原位杂交  利用具有不同颜色的荧光素分别标记不同的核酸探针,可检测同一组织或细胞内两种不同的靶核酸。用不同的荧光素作标记物进行双重标记原位杂交,有直接法和间接法两种。直接法将具有不同颜色的两种荧光素分别标记两种不同的核酸探针,用其做原位杂交,杂交信号能在荧光显微镜下通过选择不同的激发滤片而直接观察。此法操作简便,但敏感性不高。间接法用生物素和地高辛分别标记两种不同的核酸探针,然后用不同荧光素标记的亲和素(或抗生物素抗体)和抗地高辛抗体来检测杂交体。间接法比直接法敏感性更高。
 
    (三)两种放射性核素标记探针的双重标记原位杂交
    用3 H和35 S分别标记两种不同探针,用混合探针做原位杂交。在放射自显影时,标本被覆两层核乳胶,并在两层核乳胶之间用一层透明的塑料膜将其分开。因3 H的β射线能量低,故3 H的信号在第一层乳胶上;35 S的β射线能量高。它不仅能使第一层核乳胶曝光,而且还能穿透塑料薄膜使第二层核乳胶曝光,结果35 S的信号可同时在两层核乳胶中见到。两层乳胶上的信号用彩色显微放射自显影术分别显为深红色和蓝色,两种杂交信号更容易在镜下鉴别。
    此法虽能在同一标本上检出位于不同细胞中的两种靶核酸,但不能分辨位于同一细胞中的两种靶核酸。而且,该技术操作复杂、检测过程需要两次放射自显影,所费时间较长,故推广使用受到一定限制。
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序