人真皮复合培养法
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1850
实验材料:
1. 早产儿或死亡胎儿的皮肤,也可用手术取下的成体皮肤
2. 1000000U/L中性蛋白酶,0.25%胰蛋白酶
3. MEM和HBSS混合液,添加20mmol/L HEPES、200000IU/L青霉素和200mg/L链霉素和1.59g/L庆大霉素,HBSS
4. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪,眼科镊
5. 不锈钢网
6. 离心管(15ml、50ml)
实验方法:
1. 真皮的制备
(1) 取厚1.5mm的皮片,放入4℃用MEM和HBSS混合液浸洗,切成6cm×2cm的皮条。
(2) 在培养皿中加入HBSS,然后放皮条,使真皮面朝下,皮片漂浮其中。在37℃条件下,孵育8-10d,每3d换液1次。
(3) 用眼科镊将真皮与表皮分离,将真皮切成0.5cm2 小片。将真皮植块表皮面朝上放入培养皿中。
(4) 在-80℃和37℃下反复冻融植块10次,以去除存活的细胞成分,从而形成以胶原纤维网架为主的真皮组织,作为以后角质形成细胞生长的支持物,然后将真皮植块在-80℃下冷冻保存。
2. 复合培养
(1) 在37℃水浴中融化冻存的真皮植块,放入培养皿内,使真皮乳头面朝上。加入5ml培养液,在37℃条件下孵育过夜。
(2) 将角质形成细胞种植到真皮植块上,培养12h。
(3) 角质形成细胞贴附于真皮植块后,将复合培养的植块转移到无菌的不锈钢网上,移至新的培养皿内。
(4) 加入培养液,培养液的量不能超过不锈钢网高度,让表面的角质形成细胞暴露于空气当中,促进细胞分化。在加液过程中要防止气泡形成,以免破坏液气界面。
3. 结果分析
在真皮上复合培养的角质形成细胞分化能力良好,可分化形成明显的棘细胞层、颗粒细胞层和角质细胞层等表皮结构。
1. 早产儿或死亡胎儿的皮肤,也可用手术取下的成体皮肤
2. 1000000U/L中性蛋白酶,0.25%胰蛋白酶
3. MEM和HBSS混合液,添加20mmol/L HEPES、200000IU/L青霉素和200mg/L链霉素和1.59g/L庆大霉素,HBSS
4. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪,眼科镊
5. 不锈钢网
6. 离心管(15ml、50ml)
实验方法:
1. 真皮的制备
(1) 取厚1.5mm的皮片,放入4℃用MEM和HBSS混合液浸洗,切成6cm×2cm的皮条。
(2) 在培养皿中加入HBSS,然后放皮条,使真皮面朝下,皮片漂浮其中。在37℃条件下,孵育8-10d,每3d换液1次。
(3) 用眼科镊将真皮与表皮分离,将真皮切成0.5cm2 小片。将真皮植块表皮面朝上放入培养皿中。
(4) 在-80℃和37℃下反复冻融植块10次,以去除存活的细胞成分,从而形成以胶原纤维网架为主的真皮组织,作为以后角质形成细胞生长的支持物,然后将真皮植块在-80℃下冷冻保存。
2. 复合培养
(1) 在37℃水浴中融化冻存的真皮植块,放入培养皿内,使真皮乳头面朝上。加入5ml培养液,在37℃条件下孵育过夜。
(2) 将角质形成细胞种植到真皮植块上,培养12h。
(3) 角质形成细胞贴附于真皮植块后,将复合培养的植块转移到无菌的不锈钢网上,移至新的培养皿内。
(4) 加入培养液,培养液的量不能超过不锈钢网高度,让表面的角质形成细胞暴露于空气当中,促进细胞分化。在加液过程中要防止气泡形成,以免破坏液气界面。
3. 结果分析
在真皮上复合培养的角质形成细胞分化能力良好,可分化形成明显的棘细胞层、颗粒细胞层和角质细胞层等表皮结构。