人真皮复合培养法

实验材料：
1. 早产儿或死亡胎儿的皮肤，也可用手术取下的成体皮肤
2. 1000000U/L中性蛋白酶，0.25%胰蛋白酶
3. MEM和HBSS混合液，添加20mmol/L HEPES、200000IU/L青霉素和200mg/L链霉素和1.59g/L庆大霉素，HBSS
4. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊
5. 不锈钢网
6. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 真皮的制备
（1） 取厚1.5mm的皮片，放入4℃用MEM和HBSS混合液浸洗，切成6cm×2cm的皮条。
（2） 在培养皿中加入HBSS，然后放皮条，使真皮面朝下，皮片漂浮其中。在37℃条件下，孵育8-10d，每3d换液1次。
（3） 用眼科镊将真皮与表皮分离，将真皮切成0.5cm² 小片。将真皮植块表皮面朝上放入培养皿中。
（4） 在-80℃和37℃下反复冻融植块10次，以去除存活的细胞成分，从而形成以胶原纤维网架为主的真皮组织，作为以后角质形成细胞生长的支持物，然后将真皮植块在-80℃下冷冻保存。

2. 复合培养
（1） 在37℃水浴中融化冻存的真皮植块，放入培养皿内，使真皮乳头面朝上。加入5ml培养液，在37℃条件下孵育过夜。
（2） 将角质形成细胞种植到真皮植块上，培养12h。
（3） 角质形成细胞贴附于真皮植块后，将复合培养的植块转移到无菌的不锈钢网上，移至新的培养皿内。
（4） 加入培养液，培养液的量不能超过不锈钢网高度，让表面的角质形成细胞暴露于空气当中，促进细胞分化。在加液过程中要防止气泡形成，以免破坏液气界面。

3. 结果分析
在真皮上复合培养的角质形成细胞分化能力良好，可分化形成明显的棘细胞层、颗粒细胞层和角质细胞层等表皮结构。