正常人脐静脉内皮细胞的培养

实验材料：

1.  婴儿脐带；

2.  不含Ca ²⁺ 和Mg ²⁺ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3.  培养用液：M199培养液（含20%小牛血清）；0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA（1:1，V：V）混合消化液；D-Hanks液、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素；

4.  培养器具：玻璃插管与输液胶管，培养瓶或皿、白内障、眼科剪、镊子等；

培养方法：

1．  在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（长20cm以上，不宜超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分；

2．  在脐静脉两端开口处，分别用丝线扎紧并固定在50ml注射器和带输液胶管的玻璃插管上，注入D-Hanks液冲洗脐静脉，至无血迹；

3．  用止血钳夹住玻璃插管上的输液胶管，从另一端的注射器向脐静脉徐徐注入0.1%胶原酶溶液，至血管充盈。注意两端封闭，以防液体返流。立即放入37℃的无菌D-Hanks液内，15min后取出；

4．  通过注射器吸取收集酶液，同时注入含20%小牛血清的M199培养液冲洗静脉，合并于同一离心管内，以1000r/min离心7—10min；

5．  弃去离心沉淀后的上清液。加入20%小牛血清的M199培养液（pH7.2），重新悬浮细胞。并调整至细胞密度为1.5×10 ⁵ —2.0×10 ⁵ 个/ml，接种于培养瓶或培养皿中。置37℃，5%CO ₂ 培养箱培养；

6．  第二天弃培养液，用D-Hanks液轻轻洗1次，以去除不贴壁的细胞或死细胞。换入新鲜含20%小牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的M199培养液（pH7.2）。继续置37℃，5%CO₂培养箱培养；

7．  每2—3d换培养液1次。换液时将原培养液弃掉1/2—2/3，然后加入新鲜的上述培养液至原来的量。待细胞长至融合状态后，即可行传代培养；