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正常人脐静脉内皮细胞的培养

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2068

实验材料:

1. 婴儿脐带;

2. 不含Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;

3. 培养用液:M199培养液(含20%小牛血清);0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA(1:1,V:V)混合消化液;D-Hanks液、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素;

4. 培养器具:玻璃插管与输液胶管,培养瓶或皿、白内障、眼科剪、镊子等;

培养方法:

1. 在无菌条件下,取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带(长20cm以上,不宜超过6h),选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分;

2. 在脐静脉两端开口处,分别用丝线扎紧并固定在50ml注射器和带输液胶管的玻璃插管上,注入D-Hanks液冲洗脐静脉,至无血迹;

3. 用止血钳夹住玻璃插管上的输液胶管,从另一端的注射器向脐静脉徐徐注入0.1%胶原酶溶液,至血管充盈。注意两端封闭,以防液体返流。立即放入37℃的无菌D-Hanks液内,15min后取出;

4. 通过注射器吸取收集酶液,同时注入含20%小牛血清的M199培养液冲洗静脉,合并于同一离心管内,以1000r/min离心7—10min;

5. 弃去离心沉淀后的上清液。加入20%小牛血清的M199培养液(pH7.2),重新悬浮细胞。并调整至细胞密度为1.5×10 5 —2.0×10 5 个/ml,接种于培养瓶或培养皿中。置37℃,5%CO 2 培养箱培养;

6. 第二天弃培养液,用D-Hanks液轻轻洗1次,以去除不贴壁的细胞或死细胞。换入新鲜含20%小牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的M199培养液(pH7.2)。继续置37℃,5%CO2培养箱培养;

7. 每2—3d换培养液1次。换液时将原培养液弃掉1/2—2/3,然后加入新鲜的上述培养液至原来的量。待细胞长至融合状态后,即可行传代培养;

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