植物不育性的观察与鉴定技术

雄性不育是指在两性花植物中雄蕊败育的现象。有些雄性不育现象是可以遗传的，采用一定的方法可育成稳定遗传的雄性不育系。雄性不育系在杂交过程中有着重要的作用，我们都知道，杂种优势普遍存在，但很多植物由于单花结籽量少，获得杂交种子很难，从而使杂交种子生产成本太高而难以在生产中应用，利用雄性不育系配制杂交种是简化制种的有效手段，可以降低杂交种子生产成本，提高杂种率，扩大杂种优势的利用范围。 雄性不育的遗传类型可以分成下列三种：细胞质雄性不育类型，细胞核雄性不育类型和核质互作雄性不育类型。

无论植物的不育性是那种类型，它们都会在一定的组织中表现出来，有些时候不育株还会影响到内源激素的变化等。十字花科、伞形科、百合科、茄科等蔬菜作物中，普遍存在不同程度的雄性不育现象。由于遗传机制、植株营养状况、温度高低及病毒侵染与否等的不同，雄蕊退化大概可分成一下几种类型：

（一）花药退化型：一般表现为花冠较小，雄蕊的花药退化成线状或花瓣状，颜色浅而无花粉；

（二）花粉不育型：这一类花冠、花药接近正常，往往呈现亮药现象或褐药现象，药中无花粉或有少量无效花粉、镜检时，有时会发现少量 干瘪、畸形以及特大花粉粒等，大多数是无生活力的花药；

（三）花药不开裂型：这类不育型虽然能形成正常花粉，但由于花药 不开裂不能正常散粉，花粉往往由于过熟而死亡；

（四）长柱型功能不育：这一类型花柱特长，往往花蕾期柱头外露，虽然能够形成正常花粉但散落不到柱头上去；

（五）嵌合型不育：在同一植株上有的花序或花是可育的，而有的花序或花则是不育的，在一朵花中有可育花药，也有不育花药。

上述五种雄性不育型中以（一）、（二）两种类型为佳 ，利用较为方便，稳定可靠。除了上述五种雄性不育型外，还有其它类型，如环境敏感型雄性不育。根据上述不同雄性不育类型的识别、鉴定和选择雄性不育株，是对雄性不育材料的鉴定和选择的主要方法。但是，对败粉不育型通常不能用肉眼直接进行鉴定，需要用显微镜镜检，通常把过大、过小或畸形花粉作为无生活力花粉计算，统计不育率。这种镜检方法只能作为相对的直观判断，要作出准确的判断还得进行人工授粉直接测定。随着科学技术的发展，分子生物学的运用越来越广泛，植物不育性的观察和鉴定，也可借助分子生物学的手段进行，从而可以从基因水平上了解不育性的机理。实验目的是学习识别、鉴定雄性不育株的方法，并了解不同植物不育性的表现类型；通过本实验操作，学会利用不同的实验方法来鉴定植物的不育性；自行设计测交筛选保持系的方法。

下面就以萝卜为例来说明观察和鉴定其不育株的几种方法。

一、试材及用具：

1．试材：供观察和鉴定用的材料包括大白菜、甘蓝、萝卜、辣椒等雄性不育材料的开花种株。

2．用具：显微镜、镊子、凹载玻片、指形管、培养皿、离心机、电泳槽等。醋酸洋红、正丙酸洋红等试剂，缓冲液、饱和酚、凝胶以及电泳缓冲液、0.7%琼脂糖、溴化乙啶、氯仿、冰乙醇等。

二、方法步骤

（一）细胞形态学观察

在开花期取植株主茎顶端整个总状花序，按发育时期选取不同蕾长（分别为1～2、3、4、5、6和7～8mm）的花蕾，剥出花药，经镜检确定小孢子发生的5个时期：四分体时期、单核早期、单核晚期、二胞花粉期和三核花粉期。

光学显微镜观察：花药用纳瓦兴液固定，流水冲洗，梯度酒精脱水至70%酒精时，转入稀释的艾氏苏木精中整体染色，再经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，其切片厚度为5～7um。Olympus BH2型显微镜观察并拍照。

扫描电镜观察：从花瓣即将张开的花蕾中取出花药并立即放入2.5%戊二醛（0.05mol/L pH 7.2）中固定，磷酸缓冲液冲洗后换入1%高锰酸钾溶液内再固定30min；双蒸水冲洗，梯度酒精脱水；临界点干燥后剥开药室，LB－3型喷镀仪喷薄层黄金，S－520型扫描电镜观察，拍照记录。

萝卜雄性不育系花药和小孢子发生的细胞形态学观察：

1．小孢子败育 不育系中小孢子母细胞减数分裂时的某些不同步现象与其保持系基本相同。由四分体初释出的早期单核小孢子与保持系也无可见差异。但当单核小孢子的细胞质内出现小液泡时，这些小孢子即呈现败育现象：如细胞质浅染，外粉壁停止发育而显得较薄，整个小孢子小于保持系相应时期的小孢子。单核晚期的小孢子败育更趋明显：细胞质稀薄并收缩；细胞核染色也变淡，甚至在有的细胞核内只见到深染的核仁；小孢子形状不规则且大小不等。以后，小孢子的内含物愈益减少，小孢子彼此粘连，在进入雄配子体发育之前就已逐渐解体成为空壳或仅留下少量残余物，并被高度液泡化的膨大绒毡层细胞挤到药室腔中央，最后与解体的绒毡层细胞粘成团块，终至消失，开花期的花药内均未见花粉粒。

2．绒毡层异常 花药发育中药室的绒毡层细胞异常是十分普遍的现象。其细胞质内早在四分体时期即有液泡出现，胞质淡染；进入单核小孢子时期，绒毡层细胞内液泡化更加明显，整个细胞迅速膨大且凸向药室腔，细胞径向壁渐模糊。相当于单核小孢子晚期时，绒毡层细胞中的液泡继续扩大，细胞也异常肥大，常在原位彼此粘接，把败育小孢子群围在药室中央。以后，这种畸形的绒毡层和败育小孢子消失，或在药室内残留极少量的解体物。这时的花药壁也都皱缩。

（二）外部形态鉴定（花器形态以及花粉生活力观察）

在田间观察、鉴定指定作物的雄性不育株，观察记载不同不育类型，并将其不育类型加以区分。将花药可能有花粉的不育株的花，采集起来装入指形管，在管外标签上注明株号、雄性不育类型，带回室内。把不同类型雄性不育花的花药用镊子取下来，放到凹载玻片的凹处或平载玻片中央，滴上一滴醋酸洋红或正丙酸洋红，用镊子尖把花药捣碎，除去药壳及花丝等，然后放到显微镜下镜检，观察花粉形态、大小以及着色深浅等。一般瘦小干瘪、过大或畸形的花粉为无生活力或生活力弱的花粉，着色深者为生活力较强，不着色者为无生活力，着色浅为生活力较弱的花粉。但是特大花粉往往着色较深，但不能正常发芽，也归于无生活力花粉之内。

（三）分子鉴定法（叶绿体DNA的限定性内切酶分析）

1．配制缓冲液A、B、C、TE溶液、饱和酚、凝胶以及电泳缓冲液、0.7％琼脂糖、溴化乙啶，采用李继耕所用方法。

2．样品提取，300g叶片，加3倍体积缓冲液A匀浆、过滤、1500×g4℃下离心10分钟，叶绿体沉淀用缓冲液A洗两次，最后悬浮于20ml缓冲液A中，加MgCl2至0.01mol•L-1，DNA酶50ug/mL，4℃保温1h、加150mL缓冲液B，1500×g4℃下离心15min，反复洗3次，最后把叶绿体悬浮于缓冲液C中，加蛋白酶，加等体积酚，加等体积氯仿，12000×g4℃下离心15min，提取水相，反复提取2次。加两倍体积的冷乙醇于－20℃冰箱中过夜。1500×g4℃下离心10min，再加70％冷乙醇洗2次，经低温真空冷冻干燥，溶于TE缓冲液中于4℃下保存备用。

3．限制性核酸内切酶消化，EcoRI、BamHI。

4．电泳，用0.7%琼脂糖凝胶作单向垂直板电泳，稳压30V，15～20h，在0.5ug•g-1溴化乙啶中染色30min，在60nm紫外灯下观察并拍照。标准蛋白为Phamacia公司产品。EcoRI、BamHI为中科院生物物理所生化试剂厂产品。

叶绿体DNA用EcoRI消化后的电泳图式：用EcoRI消化萝卜雄性不育系401A与401B（保持系）的ctDNA内切酶切割的片段，从单向Agarose凝胶电泳分离的ctDNA限制性片断可以看出，用EcoRI消化ctDNA，不育系可以分离出分子量不同的13个片断，保持系可以分离出分子量不同的15个片断。不育系与保持系的ctDNA相比较，不育系缺E2和E4片断，而且保持系的E5、E7、E16片断比不育系药宽，从ctDNA的单向AGE图式上，只能分辨出分子量不同的片断，不能说明DNA的顺序和碱基排列的差异。把环状ctDNA分子从特异位点切开，分割成分子量不同的一些片断，从这些片断之间的差异，也可反应不育系与可育系的ctDNA基因结构的某些差异。