细胞凋亡的检测方法

<font>一、形态学检测</font>

（一）光学显微镜和倒置显微镜　　

1、未染色细胞

凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。　　

2、染色细胞

常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。　　

（二）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

常用的DNA特异性染料有：HO 33342 （Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258）， DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

（三）透射电子显微镜观察　　

结果评判：凋亡细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构，；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

<font>二、DNA凝胶电泳</font>

（一）琼脂糖凝胶电泳

凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

1、常规的琼脂糖凝胶电泳

方法一

Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

（1）收集细胞（5×106）1000r/min，离心5min，去上清。

（2）PBS洗一次，1000r/min，离心5min，去上清。

（3）加细胞核裂解液500μl重悬细胞，50℃水浴，3～5h，不时振摇或37℃过夜。

（4）加0.5ml平衡酚抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

（5）上清移至另一Ep管，加0.5ml氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

（6）上清移至另一Ep管，加50μl的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。

（7）置液氮5～10min，12 000r/min离心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。

（8）加50～100μl TE缓冲液，另加5μl RNase，37℃水浴30min。

（9）取20μl加上样缓冲液2～5μl，1％琼脂糖凝胶电泳（电压50V，1.5～2h），UV下观察。

方法二

（1）离心收集细胞（5×106），PBS（无Ca2＋和Mg2＋）洗1～2次。

（2）0.5ml TBE溶液重悬，37℃孵育30min。

（3）1mg/ml蛋白酶K 37℃处理30min。

（4）加入上样缓冲液0.1ml。

（5）25μl上样，1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，2V/cm 6h。

方法三

（1）收集细胞悬液（106细胞），低速离心（1000r/min，离心5min）。

（2）去上清，沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。

（3）13 000r/min，离心10min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加等量50％异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀，置液氮5min。

（4）12 000r/min，离心10min，弃上清，沉淀真空抽干。

（5）加TE 100μl，65℃加热10min，取20μl，加1～2μl上样缓冲液，电泳观察。

方法四

（1）收集细胞，1000r/min离心5min，去上清。

（2）用冰预冷的70％乙醇固定，可长期保存于－20℃冰箱。

（3）1000r/min离心5min，去除固定液，用约0.5ml的PBS重悬细胞。

（4）转入Eppendorf管中，同法离心，去上清。

（5）细胞用40μl PC缓冲液重悬，室温30～60min。

（6）1000r/min离心5min，吸上清于新的Eppendorf管中，真空浓缩15min。

（7）加入0.25％ NP-40溶液3μl，1mg/ml RNase A溶液3μl，37℃，30min。

（8）加入3μl蛋白酶K，37℃，30min。

（9）加入12μl样品稀释液，含溴化乙锭的1.5％琼脂糖电泳，观察

2、琼脂糖凝胶电泳的定量检测

方法一：简易末端标记法

（1）按常规提取细胞DNA。

（2）在0.5ml的EP管中加入细胞DNA，反应体系如下：细胞DNA 0.5～1.0μg，10×缓冲液2μl，32P-dATP（或-dCTP）0.5μCi，Klenow聚合酶5U，双蒸水加至20μl。

（3）混匀后稍加离心，室温反应30min。

（4）加1μl 0.5mol EDTA终止反应。

（5）常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，真空抽干。

（6）溶于20μl的TE缓冲液中。

（7）取标记DNA在1.8％琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。

（8）电泳后的凝集置滤纸上烘干，进行放射自显影。

方法二：5’末端32P标记法

细胞DNA的提取

（1）细胞悬液离心后，沉淀加消化缓冲液0.5ml，50℃ 3～5h，或37℃过夜。

（2）用等体积的酚：氯仿：异戊醇抽提细胞裂解液。

（3）将水相转移至新的试管，加入150mmol/L乙酸钠和10mmol/L氯化镁。

（4）加入2倍体积的预冷无水乙醇，置液氮5min或－20℃ 12h。

（5）12 000r/min离心沉淀DNA，70％乙醇洗1次后，真空抽干。

（6）溶于20μl的TE缓冲液中。

（7）加入终浓度为10μg/ml RNase，37℃，30min。

（8）同法用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。

（9）溶液20μl的TE缓冲液中，－20℃保存备用。DNA含量测定：用260nm波长紫外分光光度计：吸光单位为20时约为1mg/ml DNA。

3、DNA 5’末端脱磷酸

（1）取纯化的细胞DNA 10μg，然后加入：10×CIP 2μl（1U），双蒸水加至50μl。

（2）37℃水浴2h。

（3）90℃水浴5min以灭活CIP。

（4）用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。

4、DNA 5’末端32P标记

（1）将脱磷酸样品DNA置冰浴上，再加双蒸水10μl，10×缓冲液2μl，T4多核苷酸激酶10U，32P-ATP 740kBq（20μCi），双蒸水加至20μl。

（2）混合后，37℃水浴60min。

（3）加入1μl的0.5mol/L EDTA，90℃灭活5min。

5、观测

（1）取一定量的标记DNA稀释后在1.8％琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。

（2）电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进行放射自显影。

（3）含32P标记DNA电泳干凝胶进行同位素液闪测定，计算放射活性。

6、结果判断：

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

<font>三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定</font>

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

（一）检测步骤

1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；

2、在微定量板上吸附组蛋白体；

3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；

4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；

5、加酶的底物，测光吸收制。

（二）用途

该法敏感性高，可检测undefined100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

<font>四、流式细胞仪定量分析</font>

（一）检测原理

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

（二）应用价值

流式细胞仪检测具有以下特点：

1、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确

2、可以做许多相关性分析

3、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期

（1）检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。

（2）DNA片断原位标记法

凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3·的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移（ISNT）

切片常规脱蜡，梯度乙醇复水化。

将切片组织浸入2×SSC液中，80℃，20min，然后蒸馏水冲尽。

0.5%胃蛋白酶（pH2.0）37℃消化0～20min，PBS洗尽。

用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液A，5min。缓冲液A：50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L MgCl2， 10mmol/L β-巯基乙醇，0.005％BSA，pH7.5。

弃去缓冲液A，滴加标记液约50μl，25℃温育1h。标记反应液：0.005mmol/L dNTP， 0.005mol/L biotin-16-dUTP， 25U/ml Klenow大片段。

PBS漂洗2次，各3min。

内源酶阻断剂阻断15min。

PBS洗2次，各3min。

滴加HRP-avidin覆盖组织，室温下30min。

PBS洗2次，各3min。

DAB-H2O2显色约5min。

流水冲洗后，苏木素复染1min。常规脱水，透明，封片。

阴性对照片在第5步改加不含Klenow的标记液，余同。

TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）

细胞凋亡中， 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling， TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行。

3%的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶30min。

0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。

切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。

0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。

蛋白酶K或胃蛋白酶消化0～20min。

0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。

TdT缓冲液孵育10min。

TdT反应液37℃孵育1h。

切片浸泡在2×SSC溶液10min，以终止反应。

0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。

链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min。

0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。

0.04%的DAB显色5～10min，镜下控制时间。

苏木素复染3～5min，常规复水，透明和封片。

研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。

4、检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法

原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine， PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（propidine iodide， PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。　　

在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

(1)方法

悬浮细胞的染色

将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

贴壁培养的细胞染色

先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

爬片细胞染色

同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

(2)注意事项

整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

(3)结果判断

正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。

(4)应用价值

细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法

<font>五、线粒体膜势能的检测</font>

线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。　　

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。　　

（一）方法

将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。　　

（二）注意事项

1、始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。　　

2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。