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筛选了半个月后荧光变得很弱

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amenrenren:为什么筛选了半个月后荧光变得很弱呢?

转染pEGFP-目的基因后36小时候加G418一天就死了百分之78十所以从第二天起就把浓度减半了,又筛了将近十天了,发现留下的基本有荧光,但都比较弱。我分析是G418浓度太低了所致,以至于只要表达甚少就可以生存了。

所以我打算在加大浓度一下大家认为是什么原因呢?

帮我出出注意,荧光太弱到后面会不会就没了,太担心了

丁香园网友capricornkey认为:

荧光弱,说明GFP表达量少,很可能是由于G418的加入带来了筛选的抗性压力,细胞大量死亡说明转染效率不高;

若LZ使用低抗性进行筛选(1/2),容易出现假阳性,或者未经转染、不含目的片段、没有抗性的细胞在这种低抗性压力下,也适应生存下来,所以荧光值可能很弱,也有可能随后细胞逐渐死亡,荧光逐渐消失。

我认为,开始需要摸索一下G418合适的浓度,也就是要找到致细胞死亡的最低浓度,即将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100μg/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

祝实验顺利!

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