PCR技术（十）：PCR产物克隆方法

<font>平端连接</font>

通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物。

<font>粘端连接</font>

引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计 不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切 效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序 列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的 长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方 法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法 更为适宜。

<font>T4DNA聚合回切产生粘端</font>

如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在 其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。 此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需 在PCR引物的5'端加2—4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。

<font>T－vector法</font>

TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱 基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3'端突出一个 胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸 苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅 一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时， 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾 载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平 端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vector 的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅 5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。

共环消解法：最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化 连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结 构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段。对于对称 性限制酶位点，只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列，因为在串 接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制 酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切 点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。

<font>无连接酶亚克隆法(A)</font>

无连接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5’ 末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两 端分别互补的碱基。两引物的3’端约20—25个核苷酸分别与待扩增 DNA两翼互补，5’端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3’端相 同的附加序列。由于线性化质粒的3’端序列各不相同，PCR片段可 以通过选择各引物的合适5’附加序列与引物3’端定向杂交。

由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后， 分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中 用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上游引物a，引物c为下游引 物，与紧邻5’端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样，第2管的 引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上 游引物，与紧邻5’附加序列内侧的质粒（-）链互补。