PCR技术(PCR ,Polymerase chain reaction)

PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；

（一）基本要素

1、Taq DNA聚合酶：

水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶

①5’→3’DNA聚合酶活性；
　　②无3’→5’外切酶活性，
　　35轮0.25%错配，与原始模板有差别；
　　最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸
　　半衰期：92.5℃ 130mi        95℃ 40min    97.5℃5—6min
　　变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性

pfu DNA 聚合酶

耐热
　　5’→3’DNA聚合酶活性
　　3’→5’外切酶活性
　　 精确度：pfu >Taq
　　但pfu扩增效率通常比Taq酶略       
　　文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果

2、Primer 本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如： GGGTCGATTCCTACCCATGC 

注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer一般不要超过3个互补bp  

Primer 5’未端可修饰、突变:修饰，如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果；突变：AGCTCCATGACCCAG  5’CGCTCCATGACCCAG   3‘

注意：绝不可以在3’端进行上述改造 

∵DNA聚合酶是5’→3’聚合，若3’端改造→不能互补→不能延伸

primer  5’端增加碱基
　　ATG起始密码  
　　TAA、TAG、TGA终止密码  
　　 如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。

3、模板：

可选：DNA  
　　mRNA→逆转录→cDNA 
　　DNA包括：  质粒      噬菌体      染色体DNA  
　　较小       较大       ①目的gene是单拷贝  
　　变性较易   变性较难   ②非常大，变性难  
　　模板用量  
　　Plasmid:lng  
　　Chromosome:300-500ng  
　　注意：  防止交叉污染 

4、dNTP：

四种脱氧核苷酸，基本原料

终浓度：50mM 

5.Mg²⁺ 

TaqDNA聚合酶作用时需要Mg²⁺  ，不同的酶需不同Mg²⁺  
　　Taq：较少，Mg²⁺对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度  
　　pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍  
　　外界影响： EDTA鳌合Mg²⁺ ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)；DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg²⁺结合，降低Mg²⁺有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的  Mg²⁺浓度 存时间长会失效

6、温度和时间：

（1）变性温度：94-95℃

Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑

（2）退火：温度越高，扩增特异性越好

取决于Tm值：Tm↑退火T↑；
                          Tm↓退火T↓ 

若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度

（3）延伸：

￡500nt---1min    >500nt－－3min

一般：40－60sec

（二）PCR技术的应用

1. 基因检测：

2. 基因克隆化

3. DNA突变

4. DNA序列分析