PCR技术系列三：Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。yT是一种嗜热真菌，能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的。

酶活性与热稳定性

该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒。温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可 保持50%的活性，实验表明。PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶。此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性 更高。

离子依赖性

aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度。一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性。

忠实性

TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，而无3'→5'外切活 性，它不具有Klenow酶的3'→5'校对活性。因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错 配，该酶是没有校正功能的。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4.

抑制剂

低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA聚合酶的 催化活性并无影响。极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷 基肌氨酸钠(小于0.02%)，十二烷基硫酸钠(SDS，小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的 活性。而非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40.和Tritox-100)如>5%时方能 抑制该酶的活性。

变性剂对TaqDNA聚合酶活性的影响

变性剂	浓度	活性(%)
乙醇	≤3%	100
	10%	110
尿素	≤0.5mol/L	100
	1.0mol/L	118
	1.5mol/L	107
	2.0mol/L	82
DMSO	≤1%	100
	10%	53
	20%	11
DMF	≤5%	100
	10%	82
	20%	17
甲酰胺	≤1%	100
	15%	86
	20%	39
SDS	0.001%	105
	0.01%	10
	0.1%	〈0.1

低浓度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增强TaqDNA聚合酶的活性。低浓度SDS对 该酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和Tween20抵消。TaqDNA聚合酶可在-20℃贮存至少6个月。