PCR技术系列十三：PCR用于进化分析

进化遗传学具有两个并列的研究方向：系统发育的重建和种群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白质序列和基因序列的比较可以象分子种一样用于标志 现存物种分化的时间以来，各种生化方法被用于系统发育的研究。在最初二十年内， 同功酶的电泳分析、免疫学比较和蛋白质序列分析被广泛地应用。而最近，DNA-DNA 杂交和核糖体RNA序列分析为分类学做出了重要贡献。这些技术大多有局限性，因为 它们是估计而不是直接测量序列的差别。

那些把注意力集中在同功酶的分析及细胞核和细胞器DNAs限制图谱分析上的种群生物不需要具有更高分辩率的方法。直到如今，要获得比几个典型生物更多的序列数 据都是不现实的。在筛选克隆文库、制作克隆子的图谱及测序上所需的努力过大，以 至对特定物种进行更多的个体检测是不可能的。聚合酶链瓜在克服了用于进化研究的 传统DNA分析法的局限性。

通用引物

初看，对序列了解得不够好象限制了PCR的应用，因为对序列的某些了解是设计 PCR引物所必需的。幸好，有一种获得新物种引物序列的快速方法。通过选择广泛保 留在不同物种中的序列，可设计出通用引物，用于扩增一个特定细胞核或细胞器的基 因片段，此基因片段可取自一个较大类群的绝大多数成员，如：植物或真菌。这就把 系统发育的序列比较分析范围扩展到了纲或门的分类水平上。而且此法对鉴定标本和 划分生物类型在种群中的位置起重要作用。基于这些目的，线粒体DNA（mtDNA）序列 较适用。下面，我们详述对于细胞核及线粒体序列均适用的通用引物。线粒体基因法 是一个精确的检测方法；因为mtDNA进化非常快，设计此分子的引物会发生困难。

核基因引物

撏〝引物的概念在大量的_°?_RNAs直接测序中已使用多年。那些相同的引物极易 配对，通过PCR扩增核糖体DNA序列。rDNA扩增具有几个超过rRNA直接测的优点。首 先，DNA可作为起始物质，而用从组织中制备DNA比制备RNA容易。第二，样品用量更 少。最后，用各种测序酶及技术进行的DNA测序可用来从两链上获得数据并绕过核糖 体RNAs复杂的二极结构对其进行测序。

例如，我们设讦的引物可扩增许多真菌、原生动物、藻类、植物及动物的 18SrDNA上约515bp的片段（扩增区加引物约为555bp）。引物NS1和NS2的设计依据为 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、Dictyosteliumdiscoideum和 Stylonichiapustulata 18S rDNA 中的保守核苷酸序列，这在其它地方也有详述。

NS15'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'

NS25'-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3'

NSl和NS2在本章叙述的实验条件下不扩增细菌或线粒体rRNA基因。NS1和NS2扩增 片段的序列差异（对某些生物是长度的差异）有助于对分子分化进行初步估计，即在 有各种生物的自然群中决定不同的物种数量。这些引物也可用于检测在提取自动物或 植物组织的原始DNA中是否有真菌DNA的污染。Medlin及其助手详述了可扩增低等真核 生物完整的18s基因的其它引物，这些引物对于此类生物的系统发育研究比NS1和NS2 更有用。

线粒体DNA引物

对线粒体基因序列的研究适于解决许多在进化及种群生物学中的问题。因线粒体 在脊椎动物中进行无性繁殖遗传，它是重建母性系统发育的理想模型。其高速率的点 突变进化使它成为在种间进行高分辩率的种群研究的典型，其在物种中突变的迅速固 定也使其分子成为物种鉴定的理想依据，尤其是对小型生物而言。

因脊椎动物mtDNA进化速率非常快（约为核基因的10倍），寻找保守序列作为PCR 的启动位点会很困难。图1所示为扩增细胞色素b基因上一个370bp区段（扩增片段为 376bp）的两个引物的位置。经检测，细胞色素b存在于大多数脊椎动物（哺乳类、鸟 类、爬行类、两栖类和鱼类）。引物Ll4841和Hl5149在已发表的核苷酸序列的保守区 上。字母L和H表示mtDNA的轻链与重链，数字表示引物3'碱基在已发表的人类完整 mtDNA序列上的位置。

图1在脊椎动物线粒体基因组的共有结构中细胞色素b的保守引物位置。此分子编码13种蛋白质、22种tRNA.调控区也叫D-环，在细胞色素b及12srRNA基因之间。Koche 等详述了mtDNA上其它的保守引物区。

Ll48415'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3'

Hl51495'-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'

我们使用截短了的这些引物也成功地扩增了哺乳动物、鸟类及两栖类的DNA.引 物MVZ3和MVZ4的序列如上图划线部分，可扩增311bp区段（扩段片段366bp）。

细胞色素b基因上的序列含有高分辨率的系统发育信息并且在生物类群中存在范 围极广。因蛋白质结构及作用保存得相当完整，序列定位容易进行，亲缘关系近的可 通过因密码子中不活动位点的转换而发生的变化来估计，亲缘关系远的则可通过分析 颠换差异或替代氨基酸来检测。

方法

DNA制备

自消化过的组织中提取DNA，组织在100mMTrispH8.0，10mMEDTA，100mMNaCl， 0.1%SDS，50mMDTT，0.5μg/ml蛋白酶K缓冲液中37℃消化几小时。DNA用酚抽提两 次，用酚/氯仿（1:1）提纯一次，再用氯仿提纯一次，纯化的样品经离心透析或乙醇 沉淀进行浓缩。

DNA扩增及测序

扩增在100μl反应液中进行，反应液含有67mMTrispH8.8，6.7mMMgSO4，16mM硫 酸铵，10mMβ巯基乙醇，四种dDNP各1mM，两种引物各1μM，10-100ng基因组DNA，及 2.5单位TaqDNA聚合酶（PerkinElmer/Cetus）。聚合酶链反应的每个循环包括93℃变 性1分钟，50℃退火1分钟及72℃链延伸2-5分钟。此循环重复25-40次，具体次数依 DNA模板的起始浓度而定。取5μl扩增混合物在2%琼脂糖凝胶（NuSieve，FMCCorp.） 上电泳，电泳缓冲液为40mMTris-乙酸（H8.0），用溴化乙啶染色。

将含有扩增产物的胶带切下，溶于1ml蒸馏水，用1μl此溶液作为第二次链反应 的模板，制备用于测序的单链DNA.在第二次反应中，两种引物中的一个浓度减少100 倍。经40个扩增循环后，经2-4次重复离心透析除去游离核苷酸及盐。DNA用商品试剂 盒进行测序，用第二次链反应中被减少的那个作引物。

技术注意事项

通过提高些有机体DNA的退火温度，可改进扩增产物的特异性及产量。在一个引 物比例为50:1的35个循环的单链PCR反应中，增加后的特异性可使单链DNA模板直接由 起始模板产生。改进后的反应所用dDNP浓度降低（每种为32μM），循环参数为：在 93℃起始变性3分钟，然后进行35个循环，即93℃变性25秒，55℃退火25秒，55℃退 火25秒，72℃链延伸2分钟。在线状期增加72℃链延伸时间可增加用于测序的单链模 板的产量。上述循环参数与引物NSl及NS2联用扩增真菌DNA可除去在图2第1道中所出 现的多余条带。

对于许多不同个体或生物中相同基因的扩增及测序研究，必须严格地避免在DNA 分离及制备扩增产物时出现交叉污染。在配制PCR反应液时，只能使用带活动枪头及 活塞的吸量器。用一扩增DNA的吸量器决不能再用于组织DNA的分离或在另一轮扩增前 稀释DNA.不含DNA而含有所有其它试剂及稀释剂等的对照要包括在每次实验中，以检 测污染。在极端环境下，需要更换引物用以扩增靶基因上的一个不同的序列并用新吸 量器来进行DNA分离或配制PCR反应液。

结果

图2显示了用从各种生物中提取的5ng总DNA及引物NS1和NS2扩增rDNA的一个片段 的结果。约560bp的主要DNA扩增产物可从所有的被测生物样品中看到，但其在长度上 有一些小差别。因这些引物适用范围广泛，它们可用于共生笔物的检测。例如，一旦 获得一组菌根真菌和其宿主植物的序列数据，就可用种特异性DNA探针来检测及鉴定 在自然种群中的单个共生对。

mtDNA引物用于扩增多种生物的细胞色素b区段。图3显示了五种脊椎动物的细胞 色素bmtDNA序列定位。这些序列即显示了引物的通用性又显示了其定位的同线性。尽 管有显蓍的序列错配，引物仍可用于人类、鼠和牛mtDNA的扩增（图4）。

图2用NS1和NS2作引物的核小亚基rRNA基因片段的扩增结果。除退火温度为45℃ 外，扩增反应条件、电泳及溴化乙啶染色观察方法见《实验方法》一节中所述。 1.Laccariabicolor一种菌根担子菌，2.Alderglutinosa，3.果蝇（Drosophilamel anogaster）4.Anelosimusexinius，一种蜘蛛，5.Tyromycesunicolor，一种担子菌 rDNA重复单元的克隆质粒DNA.6.不含DNA的阴性对照7.空格8.标准分子量参照物（P hiX174RFHaeⅢ）

TGLFLAMHYSPDASTAFSSIAHITR25

HumanACAGGACTATTCCTAGCCATGCACTACTCACCAGACGCCTCAACCGCCTTTTCATCA ATCGCCCACATCACTCGA75

sheepACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACAACAGCATTCTCCTCT GTAACCCACATTTGCCGA75

ChickenACCGGCCTAGTACTAGCCATGCACTACACAGCAGACACATCCCTAGCCTTCTCCT CCGTAGCCCACACTTGCCGG75

saiamanderACAGGGTTATTTTTAGCTATACATTATACAGCAGATACATCATCAGCATTCT CATCCGTAGCCCACATTTGCCGA75

FishACAGGCCTTTTCCTAGCCATACACTATACCTCCGACATCGCCACCGCCTTTTCCTCCG TCGCCCACATCTGTCGT75

DVNYGWIIRYLHANGASMFFICLFL50

HumanGACGTAAATTATGGCTGAATCATCCGCTACCTTCACGCCAATGGCGCCTCAATATT CTTTATCTGCCTCTTCCTA150

SheepGACGTAAACTATGGCTGAATTATCCGATAAATACACGCAAACGGGGCATCAATATT TTTTATCTGCCTATTTATG150

ChickenAACGTACAATACGGCTGACTCATCCGGAATCTCCACGCAAACGGCGCCTCATTC TTCTTCATCTGTATCTTCCTT150

SalamanderGATGTAAATTATGGTTGACTTATACGAAATATTCACGCAAACGGCGCTTCA TTCTTTTTTATTATTATCTTTCTT150

FishGACGACGTCAACTACGGTTGACTCATCCGAAATATGCACGCCAACGGCGCATCCTTC CTCTTCATTTGTATTTAC150

HIGRGLYYGSFLYSETWNIGIILLL75

HumanCACATCGGGCGAGGCCTATATTACGGATCATTTCTCTACTCAGAAACCTGAAACA TCGGGATTATCCTCCTGCTT225

SheepCATGTAGGACGAGGCCTATACTATGGATCATATACGTTCCTAGAAACATGAAACAT TGGAGTAATCCTCCTATTC225

ChickenCACATCGGACGAGGCCTATACTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGAAAC ATTGGAGTAATTTTATTATTT225

SalamanderCATATTGGTCGAGGAATATATTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGA AACATTGGAGTAATTTTATTATTT225

FishCACATTGGCCGAGGGTTATACTATGGCTCCTATTTATATAAAGAAACCTGAAATATT GGAGTTATCCTCCTCCTT225

图3五种脊椎动物的细胞色素b的部分序列。如《实验方法》一节所述用引物 L14841和Hl5149的扩增。氨基酸序列是人类mt

DNA的翻译产物。其它序列分别是羊（绵羊，Ovisaries）、鸡（原鸡， Gullusgullus）、蝾螈（Ambystomatigrinum）和丽鱼（Julidochromisregani）的。

用错配引物进行的扩增

PRIMER

Fish5'-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3'

TEMPLATE

Human.。.。.。.。.。.。.。.。.。c.。.。.。.。.。.。.。

Cow.。.。.。.。.。.A.。.。.。.。.T.。.。.T.。.。.

Mouse.。.。.。.。.。.。T.。.。.。.T.。.。.。.。.。

图4.用错配引物进行的扩增。显示细胞色素b引物Ll4841的部分序列。尽管在引 物中部有几处错配，但它能用来扩增各种哺乳动物的模板。3'末端与模板配对完好是绝对重要的。

讨论

从任何一种生物的几个DNA分子上迅速扩增序列的技术在进化及生态学研究中有 多种用途。在此我们讨论此技术发展的前景及其在这些领域中的其它应用。

分子分类学

虽然用核酸序列数据进行分类研究的优点早已被承认，但序列比较数据的积累过 程都是繁琐的。PCR/？通用引物技术所提供的快速测序法促使分子分类学的范围扩展 到更多的类群。由序列中得出的均一数据为各种类群的生物提供了一个共同的系统发 育框图。序列数据同样也提供了过去的方法所不能提供的分辨率。线粒体DNA的扩增 和直接测序也已用地获得序列来证明在关于人类的mtDNA家系图中非洲人是其基础。 在另一项研究中，对灵长类型组织相容性基因的系统发育分析表明HLA-DQα基因座的 许多等位基因的起源早于人类的发生。

因为只需要有靶序列几个分子扩增就可以完成，许多以前很难进行分子分析的样 品都可以使用。可以用博物馆保存的及植物标本室中的标本进行工作促进了分子数据 在各种分类研究中的应用。这些技术在古代标本上的应用也是令人兴奋的。在佛罗里 达泥炭沼中保存了7000年的脑DNA中发现其含有一个在现存土蓍美洲人中不存在的新 型mtDNA.

种群生物学

序列的快速扩增使在DNA序列水平上进行大量的种群研究成为可能。单链扩增对 几十或十百个个体进行快速测序而不经过以前所需的繁琐的克隆步骤。一旦得到了一 组具代表性的序列数据，可用更方便而简单的分析方法，如用等位基因寡聚核苷酸探 针（见16章）来获得等位基因的序列数据。

对博物馆标本进行测序的工作使对过时的基因序列的研究变得更容易了。Thomas 及助手通过保存标本的皮肤mtDNA扩增研究了70年内的一系列啮齿动物类群。直至今 日用现代分子技术分析在如此长的一段时间基因序列的变异才成为可能。

生态及海洋生物学

对分析来说，传统分子技术所需的组织样品用量相对较多。尤其是许多无脊椎动 物，它们对于进行分子检测所用的一般操作方法来讲太小。因此，对于小生物、共生 生物或那些在培养基中不易生长的生物个体的直接分析是困难。聚合酶链反应有和来 扩大能进行分子检测的生物范围。现在可以直接研究象原生物和藻类等单细胞生物自 然种群的基因结构。此方法在生物的分布及数量分析中会有广泛的应用，尤其是用于 海洋环境中的生物。最后，聚合酶链反应的敏感性使其可以检出及鉴定少量的单细胞 生物、共生生物及寄生生物，既使样品是来自后二者宿主的DNA混合物中也可检出。

无损伤样品检验

用于基因分析的样品一般都需要采血样或取组织。这就限制了基因分析在行为学 及生态学研究中的应用，在这些领域中必须把对象所受的干扰减到最低。从诸如单根 头发等法医学样品中扩增序列为行为科学家及保留生物学家提供了一个新机会。无损 伤样品检验也使收集用于研究的危险生物的样品变得容易。

分子研究和生物体研究的协同

通过分子分析所开辟的物种研究新领域，我们希望在分子生物学家及种群生物学 家之间建立大量的相互合作。例如为系统发育的重建所收集的比较序列可清楚地显示 出蛋白质的结构及作用。通常不在实验室里进行的，对适应独特环境的生物体的分子 研究可能会揭示独物的分子适应性变化。相反，对遗传变异体的分子结构的了解也有 助于我们了解生物体是如何进化的。