PCR技术系列十三：PCR用于进化分析

进化遗传学具有两个并列的研究方向：系统发育的重建和种群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白质序列和基因序列的比较可以象分子种一样用于标志 现存物种分化的时间以来，各种生化方法被用于系统发育的研究。在最初二十年内， 同功酶的电泳分析、免疫学比较和蛋白质序列分析被广泛地应用。而最近，DNA-DNA 杂交和核糖体RNA序列分析为分类学做出了重要贡献。这些技术大多有局限性，因为 它们是估计而不是直接测量序列的差别。

那些把注意力集中在同功酶的分析及细胞核和细胞器DNAs限制图谱分析上的种群生物不需要具有更高分辩率的方法。直到如今，要获得比几个典型生物更多的序列数 据都是不现实的。在筛选克隆文库、制作克隆子的图谱及测序上所需的努力过大，以 至对特定物种进行更多的个体检测是不可能的。聚合酶链瓜在克服了用于进化研究的 传统DNA分析法的局限性。

<font>通用引物</font>

初看，对序列了解得不够好象限制了PCR的应用，因为对序列的某些了解是设计 PCR引物所必需的。幸好，有一种获得新物种引物序列的快速方法。通过选择广泛保 留在不同物种中的序列，可设计出通用引物，用于扩增一个特定细胞核或细胞器的基 因片段，此基因片段可取自一个较大类群的绝大多数成员，如：植物或真菌。这就把 系统发育的序列比较分析范围扩展到了纲或门的分类水平上。而且此法对鉴定标本和 划分生物类型在种群中的位置起重要作用。基于这些目的，线粒体DNA（mtDNA）序列 较适用。下面，我们详述对于细胞核及线粒体序列均适用的通用引物。线粒体基因法 是一个精确的检测方法；因为mtDNA进化非常快，设计此分子的引物会发生困难。

<font>核基因引物</font>

撏〝引物的概念在大量的_°?_RNAs直接测序中已使用多年。那些相同的引物极易 配对，通过PCR扩增核糖体DNA序列。rDNA扩增具有几个超过rRNA直接测的优点。首 先，DNA可作为起始物质，而用从组织中制备DNA比制备RNA容易。第二，样品用量更 少。最后，用各种测序酶及技术进行的DNA测序可用来从两链上获得数据并绕过核糖 体RNAs复杂的二极结构对其进行测序。

例如，我们设讦的引物可扩增许多真菌、原生动物、藻类、植物及动物的 18SrDNA上约515bp的片段（扩增区加引物约为555bp）。引物NS1和NS2的设计依据为 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、Dictyosteliumdiscoideum和 Stylonichiapustulata 18S rDNA 中的保守核苷酸序列，这在其它地方也有详述。

NS15'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'

NS25'-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3'

NSl和NS2在本章叙述的实验条件下不扩增细菌或线粒体rRNA基因。NS1和NS2扩增 片段的序列差异（对某些生物是长度的差异）有助于对分子分化进行初步估计，即在 有各种生物的自然群中决定不同的物种数量。这些引物也可用于检测在提取自动物或 植物组织的原始DNA中是否有真菌DNA的污染。Medlin及其助手详述了可扩增低等真核 生物完整的18s基因的其它引物，这些引物对于此类生物的系统发育研究比NS1和NS2 更有用。

<font>线粒体DNA引物</font>

对线粒体基因序列的研究适于解决许多在进化及种群生物学中的问题。因线粒体 在脊椎动物中进行无性繁殖遗传，它是重建母性系统发育的理想模型。其高速率的点 突变进化使它成为在种间进行高分辩率的种群研究的典型，其在物种中突变的迅速固 定也使其分子成为物种鉴定的理想依据，尤其是对小型生物而言。

因脊椎动物mtDNA进化速率非常快（约为核基因的10倍），寻找保守序列作为PCR 的启动位点会很困难。图1所示为扩增细胞色素b基因上一个370bp区段（扩增片段为 376bp）的两个引物的位置。经检测，细胞色素b存在于大多数脊椎动物（哺乳类、鸟 类、爬行类、两栖类和鱼类）。引物Ll4841和Hl5149在已发表的核苷酸序列的保守区 上。字母L和H表示mtDNA的轻链与重链，数字表示引物3'碱基在已发表的人类完整 mtDNA序列上的位置。

图1在脊椎动物线粒体基因组的共有结构中细胞色素b的保守引物位置。此分子编码13种蛋白质、22种tRNA.调控区也叫D-环，在细胞色素b及12srRNA基因之间。Koche 等详述了mtDNA上其它的保守引物区。

Ll48415'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3'

Hl51495'-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'

我们使用截短了的这些引物也成功地扩增了哺乳动物、鸟类及两栖类的DNA.引 物MVZ3和MVZ4的序列如上图划线部分，可扩增311bp区段（扩段片段366bp）。

细胞色素b基因上的序列含有高分辨率的系统发育信息并且在生物类群中存在范 围极广。因蛋白质结构及作用保存得相当完整，序列定位容易进行，亲缘关系近的可 通过因密码子中不活动位点的转换而发生的变化来估计，亲缘关系远的则可通过分析 颠换差异或替代氨基酸来检测。

<font>方法</font>

DNA制备

自消化过的组织中提取DNA，组织在100mMTrispH8.0，10mMEDTA，100mMNaCl， 0.1%SDS，50mMDTT，0.5μg/ml蛋白酶K缓冲液中37℃消化几小时。DNA用酚抽提两 次，用酚/氯仿（1:1）提纯一次，再用氯仿提纯一次，纯化的样品经离心透析或乙醇 沉淀进行浓缩。

DNA扩增及测序

扩增在100μl反应液中进行，反应液含有67mMTrispH8.8，6.7mMMgSO4，16mM硫 酸铵，10mMβ巯基乙醇，四种dDNP各1mM，两种引物各1μM，10-100ng基因组DNA，及 2.5单位TaqDNA聚合酶（PerkinElmer/Cetus）。聚合酶链反应的每个循环包括93℃变 性1分钟，50℃退火1分钟及72℃链延伸2-5分钟。此循环重复25-40次，具体次数依 DNA模板的起始浓度而定。取5μl扩增混合物在2%琼脂糖凝胶（NuSieve，FMCCorp.） 上电泳，电泳缓冲液为40mMTris-乙酸（H8.0），用溴化乙啶染色。

将含有扩增产物的胶带切下，溶于1ml蒸馏水，用1μl此溶液作为第二次链反应 的模板，制备用于测序的单链DNA.在第二次反应中，两种引物中的一个浓度减少100 倍。经40个扩增循环后，经2-4次重复离心透析除去游离核苷酸及盐。DNA用商品试剂 盒进行测序，用第二次链反应中被减少的那个作引物。

<font>技术注意事项</font>

通过提高些有机体DNA的退火温度，可改进扩增产物的特异性及产量。在一个引 物比例为50:1的35个循环的单链PCR反应中，增加后的特异性可使单链DNA模板直接由 起始模板产生。改进后的反应所用dDNP浓度降低（每种为32μM），循环参数为：在 93℃起始变性3分钟，然后进行35个循环，即93℃变性25秒，55℃退火25秒，55℃退 火25秒，72℃链延伸2分钟。在线状期增加72℃链延伸时间可增加用于测序的单链模 板的产量。上述循环参数与引物NSl及NS2联用扩增真菌DNA可除去在图2第1道中所出 现的多余条带。

对于许多不同个体或生物中相同基因的扩增及测序研究，必须严格地避免在DNA 分离及制备扩增产物时出现交叉污染。在配制PCR反应液时，只能使用带活动枪头及 活塞的吸量器。用一扩增DNA的吸量器决不能再用于组织DNA的分离或在另一轮扩增前 稀释DNA.不含DNA而含有所有其它试剂及稀释剂等的对照要包括在每次实验中，以检 测污染。在极端环境下，需要更换引物用以扩增靶基因上的一个不同的序列并用新吸 量器来进行DNA分离或配制PCR反应液。