质粒DNA的分离、纯化和鉴定（三）

11、将树脂/DNA 混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA 进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。

12、真空抽干所加入的洗脱。

13、 再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。

14、 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。

15、 取出柱子，真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。

16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5分钟。

17、 取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA ,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。

[注意]

1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。

2. 纯化树脂必须混匀后再用.

（三）Sephrose 2B柱纯化质粒DNA

碱法提取的质粒DNA 即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA 制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA 纯化。

1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。

2、将至多1ml的DNA 溶液铺在Sepharase 2B柱上。

3、待DNA 溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。

4、以1ml流出液为1份进行收集。

5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA 。通常质粒DNA 在柱上流出的第一个峰中。

6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。

7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟,然后4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。

8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。

9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。

[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱内的凝胶均匀。