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紫外吸收法对过氧化氢酶活性的测定

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3380

实验原理

H2 O2 在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240 )随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

实验试剂

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮);

0.1mol/L H2 O2 (用0.1mol/L高锰酸钾标定)。

实验设备

紫外分光光度计;离心机;研钵;250ml容量瓶1个;0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支;10ml试管3支;恒温水浴。

实验步骤

1. 酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2. 测定:取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表顺序加入试剂。

表 紫外吸收法测定H2 O2 样品液配置表

管 号

S1

S2

S3

粗酶液(ml)

0.2

0.2

0.2

pH7.8磷酸(ml)

1.5

1.5

1.5

蒸馏水(ml)

1.0

1.0

1.0

25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2 O2 ,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性。

3. 结果计算:

以1min内A240 减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=

式中 A240 = AS0

AS0 —加入煮死酶液的对照管吸光值;

AS1 , AS2 —样品管吸光值;

Vt—粗酶提取液总体积(ml);

V1 —测定用粗酶液体积(ml);

FW—样品鲜重(g);

0.1—A240 每下降0.1为1个酶活单位(u);

t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

注意事项

凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

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