银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察

实验原理

在细胞分裂中期核型中，人的端着丝粒染色体短臂区和在间期细胞核的核仁中有与银离子特异亲合物质，通过银染可以显示它们的致量，因此一直被人们所关注。近年来发现，虽然人的端着丝粒染色体短臂是 28S、18S、和 5.8S rRNA 基因存在部位，称核仁形成区(Nucleolar organizer region，NOR)，但银染的物质不是 rDNA 和 rRNA，而是与活性的 rDNA转录有关的一类酸性蛋白质，容易将 Ag 离子还原为 Ag 的颗粒，从而在核仁形成区镀上银、呈棕黑色，称为银染核仁形成区(Silver—Staining nucleolar organizer region，Ag—NOR)。生化和免疫化学研究证明银染蛋白是RNA聚合酶I，其功能是催化rDNA转录rRNA形成核仁，因此通过这种反应能够特异显示 rRNA 转录的活性。

由于银染核仁形成区方法简便、特异性强，目前在遗传、肿瘤、药物毒理及预防医学等细胞生物学研究中，均有广泛应用。特别是电镜银染活性核仁形成区技术，可以在同一个细胞中显示银染蛋白、活性 rDNA 和 rRNA 三者间关系，并在亚细胞水平进行分析。

实验试剂

Carnoy 固定液(用时现配)、5N HCl、0.1％甲酸、l％甲酸、50％AgNO₃ (用时现配)、2％蛋白胶、5％硫代硫酸钠、2.5％戊二醛、30％～100％梯度乙醇和丙酮、Epon一812 包埋剂、醋酸铀和柠檬酸铅染液、蒸馏水。

实验设备

显微镜、电子显微镜、超薄切片机、水浴箱、离心机、天平、染色缸、平皿、乳头吸管、离心管、擦镜纸。

实验材料

人外周血淋巴细胞核型标本、HL一60 细胞、HeLa 细胞。

实验步骤

1. 中期染色体核仁形成区的银染和观察

(1) 取制备好的正常或肿瘤细胞染色体标本，直接放入装有 5N HCl 溶液中，常温处理 5分钟；

(2) 用自来水反复冲洗几次，甩干，标本面朝上平放在平皿中；

(3) 将 0.1％甲酸临用前配制的 50％AgNO，溶液约 0.5ml,用吸管滴在标本上，再盖上二片擦镜纸；

(4) 放置平皿于 56℃水浴中处理 3～5 分钟，待擦镜纸呈棕色后，取出标本用水冲洗、气干；

(5) 镜检。

镜下所见标本背景浅黄色，核型深染，端着丝粒染色体的银染蛋白存在的部位呈棕黑色颗粒，选择染色体分散良好，银染颗粒清楚的分裂相，进行计数单侧或双侧有银染颗粒的染色体数。

人体细胞银染颗粒有遗传稳定性，一般正常值为4～8 个／核型。

计算方法

NOR 均值=N 个核型中含 NOR 染色体数的和/N 个核型

2. 间期细胞核活性核仁形成区的银染与观察

(1) 收集培养的 HL—60 细胞和用 PHA 转化的人正常外周血淋巴细胞分别于离心管中，用 1000rpm 离心 5 分钟后弃上清；

(2) 用吸管吸打或用指弹法使细胞悬浮，然后用 Carnoy 固定液固定 30 分钟；

(3) 以 1000rpm 离心 5 分钟，弃上清剩约 0.5～0.1ml 液体，使细胞悬浮后滴片；

(4) 37℃干燥 24 小时；

(5) 银染(程序同前)；

(6) 镜检。

镜下所见，细胞核着色而细胞质不着色，核中活性核仁形成区银染颗粒呈棕黑色，成簇聚集，清晰可分。肿瘤细胞中与正常细胞中的银染颗粒数量、可见有明显差异。

3. 间期细胞核银染活性核仁形成区电镜标本制备与观察

(1) 收集培养的 HL--60 细胞或 HeLa 细胞于离心管中，随后加入 2.5％戊二醛 1ml 预固定 10 分钟；

(2) 以 1000rpm 离心 10 分钟，弃上清后加入 Carnoy 固定液固定 5 分钟；

(3) 接着以 2500rpm 离心 l0 分钟，弃净上清并用吸水纸吸干残余液体，用耳勺取出细胞团块放于小平皿中；

(4) 100％乙醇→双蒸水梯度复水，每步 5 分钟；

(5) 然后将细胞团切成约 1mm 3 大小的块；

(6) 将 50％AgN03(用蒸馏水配制)—2％蛋白胶(用 1％甲酸配制)2:1 混合液 2～3ml，加入有细胞团块的小平皿中；

(7) 移置平皿于 56℃水浴中处理 20 分钟；

(8) 彻底水洗 3 次，每次 2～3 分钟；

(9) 水洗后 5％硫代硫酸钠室温处理 l0分钟；

(10) 再水洗 3 次，转入乙醇一丙酮梯度脱水，每步 5 分钟；

(11) Epon812 包埋；

(12) 超簿切片直接地或再经醋酸铀和柠檬酸铅复染后，在电镜下观察。

镜下所见，经铀、铅复染的标本，细胞核中电子密度大的是核仁纤维中心(Fibrillar

Centre,FC)和致密纤维成分(Dense fibrillar component，DFC)它们是银染蛋白和正在转录的 rRNA 基因存在的部位；周围电子密度均匀，着色浅的为 rRNA 前体和核糖体大、小亚单位存在的颗粒成分(Granular component，GC)。

超薄切片不经铀、铅复染，直接在透射电镜下观察，显示银染蛋白颗粒只存在于 FC 和DFC 中，在周围 GC 中很少存在。