鼻内应用免疫调节分子:肺癌局部免疫疗法的探讨
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实验试剂
PBS(Gibco-Invitrogen;cat. no. 14190)
DMEM培养液(Gibco-Invitrogen;cat.no.41965-039)用于B16 - F10细胞的培养
RPMI 1640(Gibco-Invitrogen;cat.no. A10491-01)用于 L1C2细胞的培养
台盼蓝((Biochrom AG;cat.no. L6323)
实验设备
异氟醚麻醉设备(Eickemeyer Medizintechnik)使用异氟醚麻醉时
实验步骤
准备DMEM培养液 10%的FCS,1%青霉素/链霉素,B16F10细胞和RPMI 10%FCS的 1%青霉素/链霉素,L1C2细胞在4°C保存。
5.在50毫升培养瓶中培养细胞1-2天,直到细胞达到70-80%融合。
25厘米2瓶加入胰酶0.5毫升,75厘米2培养瓶加入胰酶1毫升,175厘米2培养瓶加入胰酶2毫升
11. 重悬细胞,用75厘米2或175厘米2细胞瓶扩大培育。
15.细胞计数,加入10μL混合液至计数板中计数。数4个小格中细胞数(Q1-Q4)
16.细胞计数公式:(Q1 Q2 Q3 Q4)/4×2 (台盼蓝稀释度) x104
17.取小鼠细胞体积(浓度2×105 )然后4°C离心7分钟。
18. 用sterofundin悬浮B16 -F10细胞或RPMI悬浮L1C2细胞使其浓度为1× 106 细胞/ ml(200μL/ 2×105 细胞注入老鼠)。
20.将老鼠固定在注射板上,将尾巴放入三角瓶30秒,或者尾巴也可以使用红外线灯加热。
氯胺酮(12mg/ml)/ xylazin(0.088ml/ml)溶解于PBS,4°C保存。
注意:所有的实验中,应根据国家和机构的关于动物护理和使用的指导方针进行。
25. 当小鼠处于麻醉状态时心脏跳动越来越慢,钳住脖子使其后脑勺倾斜。仔细的滴入溶液,使液滴从鼻子能通到嘴里,让小鼠嘴也能吸到溶液。
26. 等待小鼠苏醒。鼠三溴乙醇和氯胺酮治疗后需要大约30分钟才能清醒。麻醉持续时间约5分钟后,异氟醚治疗。使用红外线灯暖鼠标,直到它清醒。