蒸发光散射检测技术
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蒸发光散射检测技术
魏泱 丁明玉~Kbr_~H~M~2~1（清华大学化学系 北京 100084）
提要 对HPLC中的蒸发光散射检测技术进行了综述。重点介绍了蒸发光散射检测器的仪器构造，工作原理，影响检测的因素和提出的一些理论及其在类酯、表面活性剂和药物成分等物质检测方面的应用。
关键词 蒸发光散射检测，工作原理，检测理论，类酯，表面活性剂，药物。
1．概述
高效液相色谱（HPLC）日益普及，所涉及的样品分析范围也越来越广。检测器作为高效液相色谱仪的一个重要组成部分，其发展在某种意义上决定着HPLC技术的进步。高灵敏度，性能稳定的通用型检测器的缺乏，在一定程度上制约了HPLC的应用[1]。
紫外检测器（UVD）因其高灵敏度和稳定性，在HPLC中应用最广泛。但它所能检测的物质必须具有吸收紫外光的生色团，而相应的流动相在检测波长下则应当是无紫外吸收的。这一特性大大限制了其能检测的物质范围和一些良好溶剂的使用。示差折光检测器（RID）是一种通用的检测器，它基于色谱柱流出物光折射率的变化来连续测定样品浓度。但它对工作环境要求很苛刻，要求恒温，恒流速，且无法采用梯度洗脱，其检测灵敏度也不够高。
蒸发光散射检测器（Evaporative Light-Scattering Detector ，ELSD）的出现，在一定程度上弥补了HPLC传统检测器的不足，特别是对无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测，显示出其优越性。本文综述了ELSD的工作原理与检测过程中的理论研究，及其在类酯、表面活性剂和药物成分等物质检测方面的应用。
2．仪器构造和工作原理
1966年，Ford 等[2]第一次介绍了ELSD，当时它的名字叫蒸发分析器（evaporative analyzer）。ELSD在发展过程中还曾有过如下一些不同的名字，散射测浊器（nephelometer），质量检测器（mass detector），光散射检测器（light scattering detector）[3]。目前主要有四种商品化的ELSD，即：Sedex55/65、 Eurosep、 PL-ELS和Alltech 500。其中Sedex55/65和Eurosep的结构差不多；PL-ELS和Alltech 500都是由Varex MK―Ⅲ ELSD发展而来，其结构见图1[4]。
总体上来讲，四种商品化的ELSD都由三部分组成，即雾化器，加热漂移管，光散射池。雾化器与分析柱出口直接相连，柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和充入的气体（通常为氮气）混合形成均匀的微小液滴，可通过调节气体和流动相的流速来调节雾化器产生液滴的大小。漂移管的作用在于使气溶胶中的易挥发组分挥发，流动相中的不挥发成分经过漂移管进入光散射池。在光散射池中，样品颗粒散射光源发出的光，经检测器检测散射光，产生电信号。ELSD采用的光源除Alltech 500使用670nm激光二极管，其余的使用卤素灯。检测器为光电倍增管或硅晶体光电二极管，其发展趋势是硅晶体光电二极管逐步取代光电倍增管。ELSD的构造决定了其运行为三个过程：1.用惰性气体把色谱柱流出物雾化；2.在漂移管中把流动相蒸发；3.测定留下来的样品颗粒的光散射。四种ELSD的运行模式有两种，其区别在于：类型A的操作是全部柱流出物都进入直的漂移管，让流动相在其中蒸发；类型B的操作是把柱流出物通过一个弯管，在此管中大的颗粒沉积下来流入废气管，其余的小颗粒进入螺旋状的蒸发管(见图1)。最近，Alltech公司提供了一种名为低温适配器（Lower Temperature Adaptor）的可移动部件，可以很容易地将类型A的ELSD转化为类型B的ELSD。
图1 两种类型的 ELSD
Wilcox[5]考察了这两种类型的ELSD，他认为类型A的ELSD把所有的气溶胶都送到漂移管中，为了有利于蒸发常常使用较高的操作温度，因此它适合于检测不挥发的样品，使用流速为1.0ml/min（或更低流速）的挥发性流动相进行分析。类型B的ELSD将大颗粒气溶胶撞在弯曲管管壁上除去，使气溶胶粒度分布变窄，在较低的温度下易于蒸发，适合于检测半挥发性样品，以流速为1.5ml/min（或更高流速）的高含水流动相进行分析。
3.影响检测的因素及检测过程的理论研究
尽管ELSD有两种模式，但其检测原理是相同的。Charlesworth[6]奠定了ELSD检测的理论基础，以后的研究者如：Stolyhwo等[7，8]，Mourey和Oppenheimer[9，10]，Righezza等[11~13]都是在其研究基础进一步发展该理论的。他们对于ELSD检测理论的研究成果由Mengerink 等[14]系统地总结如下：
⑴雾化：柱流出物进入雾化器后，与充入的气体混合形成液滴，液滴的平均直径D0可以用Nakiyama和Tanasawa提出的公式计算：
(1)
其中D0为液滴平均直径(μm)；σ为洗脱液的表面张力(N/m)；Δu为液体和气体之间的线速差(m/s)；η为柱流出物的粘度(Pa・s)；ρ为柱流出物的密度(kg/m3)；FL/Fg为柱流出物与气体流速比。
最初的液滴直径分布为高斯分布或非对称的正态分布。
⑵液滴进入到加热的漂移管中，至少有三个现象发生：易挥发的部分蒸发；一些颗粒落到漂移管的管壁上；一些颗粒凝结在一起。
Charlesworth提出了计算柱流出物蒸发时间的公式：
（2）
其中：td为完全挥发的时间；ΔHv/M为摩尔挥发度（该值与达到1毫米汞柱蒸气压时的温度成正比）；ΔT为雾化气体与液体表面温度差；Kf为液滴周围气体薄层的热导率。
当温度上升到一定程度，被分析物（x）亦会同流动相（o）一道挥发，因此最佳的温度为tdo<td<tdx。为了减小颗粒在漂移管管壁上的沉淀，td的选择最好是比tdx略高一点。FL/Fg增大则会使颗粒间更易凝结。
⑶在可以忽略漂移管管壁上的沉淀或颗粒凝结在一起而改变平均直径的情况下，进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径与被分析物在洗脱液中的浓度C成比例：
(3)
其中ρa为被分析物的密度。
对于轴心式的雾化器，当被分析物浓度为1mg/L时，被分析物颗粒的大小处在米氏散射区域。根据米氏理论，散射光强I可以表示为：
(4)
其中k为常数；N是散射区域中颗粒的数目；随着d/λ的增加，y值从4.0（瑞利散射区域）减小到-2.2。当λ和N为常数，散射强度以dp（p<6）增加，因此从式(3)可以看出，散射强度以cq（q<2）增加。
⑷校正曲线和检测限
当被分析物在洗脱液中的浓度较低时，被分析物浓度值的对数与响应值的对数的校正曲线大致呈线性。检测限可以通过公式算出：
(5)
其中mLOD为检测限（g）；m为注入的被分析物的质量（g）；N/H为噪音与峰高之比；x为校正曲线的斜率。
之后，Meeren等[15]建立了一个计算机模拟的ELSD检测机理模型，其基本理论也是建立在米氏理论的基础上。他们把影响ELSD的响应的因素分成四组：载气气压，雾化器的设计，流动相的组成和流速都将影响到雾化过程；被分析物的浓度和密度等决定了进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径；被分析物的折射指数，光源发出的光的强度和波长，光电倍增管的位置等将影响到散射光强度；光电倍增管的灵敏度和入射光的强度决定了检测的效率，即反映为实验者所观测到的峰面积。
冯埃生等[16] 和Trathnigg等[17]考察了影响ELSD检测性能的基本因素，他们发现漂移管温度对基线水平和噪音的影响没有明显的规律性，温度过低流动相得不到充分挥发，使基线水平较高；温度过高则可能带来更大的噪音。气体流速增大，使响应值减小，故最佳气速是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值的最低气体。流动相中可以加入低于10mmol/L的挥发盐来调节所需的酸度。他们在实验中也发现，峰面积和峰高的自然对数分别与浓度的自然对数有较好的线性关系。
此外，还有不少实验者在用ELSD检测各种物质时，不同程度地研究了影响ELSD检测性能的基本因素，但其研究都不够系统，而且没有提出相应的理论。
4. ELSD在HPLC中的应用研究
ELSD在对类酯[18~23]、表面活性剂[24~27]、糖[28，29]、氨基酸[30，31]、 季铵盐[32，33]、高聚物[34~36]、甾体化合物[37~39]等物质的检测，以及药物分析方面[40~45]发挥着重要的作用。
归纳起来，这些物质往往具有如下的特点：1.物质本身不含生色团或吸光系数不大，使用UVD检测灵敏度很低。2.物质组分复杂，组分间极性差异较大，分离需要进行梯度洗脱，故RID几乎不适用，短波长UVD在梯度洗脱时常会发生基线漂移。使用ELSD检测，可以克服这些困难。对于不含生色团的物质，ELSD可以不经衍生，直接进行检测，从而避免了衍生带来的误差；ELSD在检测过程中，将流动相完全挥发，因此在梯度洗脱时，基线平稳。对不同物质，ELSD响应因子的变化比其他检测器（如紫外检测器）要小得多，在因缺乏标准品而无法做校正曲线的情况下，利用ELSD可以近似地提供不纯物的定量测定。HPLC/ELSD的色谱条件与LC/MS是一致的，在脱机情况下，使用HPLC/ELSD可以为LC/MS摸索色谱条件，节省使用昂贵的LC/MS系统的操作成本，而且可以方便地用LC/MS来分析检测出的不纯物，进行结构判定。
5. 结论
在以上的研究中，实验者都要对ELSD进行条件优化，即通过调节载气流速和漂移管的温度，使信噪比达到最大。
ELSD的响应不依赖于物质的光学性质，能检测挥发性低于流动相的样品。其检测灵敏度高，检测限已可达ng级；检测过程中，其基线稳定，能进行梯度洗脱。
许多实验都表明，ELSD的响应值与被测物浓度的关系曲线比较复杂，在较高浓度范围内，大致呈线性；而在低浓度范围内，则大致呈指数关系，即满足A=acb，且b值往往在1―2之间(与理论相符合)；另有少数实验表明，响应值与被测物浓度为二次函数关系，即Y=aX+bX2。
理论表明，ELSD的响应与被分析物的理化性质有一定关系，但这种关系并不大，某些实验也证明了这一点，从这个意义上来讲，ELSD不能被称为真正的质量检测器；由于被测物往往为同一类物质，其性质比较类似，因此许多实验者报道响应不依赖于被分析物的理化性质，理论与实际并不矛盾。
参考文献
魏泱 丁明玉~Kbr_~H~M~2~1（清华大学化学系 北京 100084）
提要 对HPLC中的蒸发光散射检测技术进行了综述。重点介绍了蒸发光散射检测器的仪器构造，工作原理，影响检测的因素和提出的一些理论及其在类酯、表面活性剂和药物成分等物质检测方面的应用。
关键词 蒸发光散射检测，工作原理，检测理论，类酯，表面活性剂，药物。
1．概述
高效液相色谱（HPLC）日益普及，所涉及的样品分析范围也越来越广。检测器作为高效液相色谱仪的一个重要组成部分，其发展在某种意义上决定着HPLC技术的进步。高灵敏度，性能稳定的通用型检测器的缺乏，在一定程度上制约了HPLC的应用[1]。
紫外检测器（UVD）因其高灵敏度和稳定性，在HPLC中应用最广泛。但它所能检测的物质必须具有吸收紫外光的生色团，而相应的流动相在检测波长下则应当是无紫外吸收的。这一特性大大限制了其能检测的物质范围和一些良好溶剂的使用。示差折光检测器（RID）是一种通用的检测器，它基于色谱柱流出物光折射率的变化来连续测定样品浓度。但它对工作环境要求很苛刻，要求恒温，恒流速，且无法采用梯度洗脱，其检测灵敏度也不够高。
蒸发光散射检测器（Evaporative Light-Scattering Detector ，ELSD）的出现，在一定程度上弥补了HPLC传统检测器的不足，特别是对无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测，显示出其优越性。本文综述了ELSD的工作原理与检测过程中的理论研究，及其在类酯、表面活性剂和药物成分等物质检测方面的应用。
2．仪器构造和工作原理
1966年，Ford 等[2]第一次介绍了ELSD，当时它的名字叫蒸发分析器（evaporative analyzer）。ELSD在发展过程中还曾有过如下一些不同的名字，散射测浊器（nephelometer），质量检测器（mass detector），光散射检测器（light scattering detector）[3]。目前主要有四种商品化的ELSD，即：Sedex55/65、 Eurosep、 PL-ELS和Alltech 500。其中Sedex55/65和Eurosep的结构差不多；PL-ELS和Alltech 500都是由Varex MK―Ⅲ ELSD发展而来，其结构见图1[4]。
总体上来讲，四种商品化的ELSD都由三部分组成，即雾化器，加热漂移管，光散射池。雾化器与分析柱出口直接相连，柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和充入的气体（通常为氮气）混合形成均匀的微小液滴，可通过调节气体和流动相的流速来调节雾化器产生液滴的大小。漂移管的作用在于使气溶胶中的易挥发组分挥发，流动相中的不挥发成分经过漂移管进入光散射池。在光散射池中，样品颗粒散射光源发出的光，经检测器检测散射光，产生电信号。ELSD采用的光源除Alltech 500使用670nm激光二极管，其余的使用卤素灯。检测器为光电倍增管或硅晶体光电二极管，其发展趋势是硅晶体光电二极管逐步取代光电倍增管。ELSD的构造决定了其运行为三个过程：1.用惰性气体把色谱柱流出物雾化；2.在漂移管中把流动相蒸发；3.测定留下来的样品颗粒的光散射。四种ELSD的运行模式有两种，其区别在于：类型A的操作是全部柱流出物都进入直的漂移管，让流动相在其中蒸发；类型B的操作是把柱流出物通过一个弯管，在此管中大的颗粒沉积下来流入废气管，其余的小颗粒进入螺旋状的蒸发管(见图1)。最近，Alltech公司提供了一种名为低温适配器（Lower Temperature Adaptor）的可移动部件，可以很容易地将类型A的ELSD转化为类型B的ELSD。
图1 两种类型的 ELSD
Wilcox[5]考察了这两种类型的ELSD，他认为类型A的ELSD把所有的气溶胶都送到漂移管中，为了有利于蒸发常常使用较高的操作温度，因此它适合于检测不挥发的样品，使用流速为1.0ml/min（或更低流速）的挥发性流动相进行分析。类型B的ELSD将大颗粒气溶胶撞在弯曲管管壁上除去，使气溶胶粒度分布变窄，在较低的温度下易于蒸发，适合于检测半挥发性样品，以流速为1.5ml/min（或更高流速）的高含水流动相进行分析。
3.影响检测的因素及检测过程的理论研究
尽管ELSD有两种模式，但其检测原理是相同的。Charlesworth[6]奠定了ELSD检测的理论基础，以后的研究者如：Stolyhwo等[7，8]，Mourey和Oppenheimer[9，10]，Righezza等[11~13]都是在其研究基础进一步发展该理论的。他们对于ELSD检测理论的研究成果由Mengerink 等[14]系统地总结如下：
⑴雾化：柱流出物进入雾化器后，与充入的气体混合形成液滴，液滴的平均直径D0可以用Nakiyama和Tanasawa提出的公式计算：
(1)
其中D0为液滴平均直径(μm)；σ为洗脱液的表面张力(N/m)；Δu为液体和气体之间的线速差(m/s)；η为柱流出物的粘度(Pa・s)；ρ为柱流出物的密度(kg/m3)；FL/Fg为柱流出物与气体流速比。
最初的液滴直径分布为高斯分布或非对称的正态分布。
⑵液滴进入到加热的漂移管中，至少有三个现象发生：易挥发的部分蒸发；一些颗粒落到漂移管的管壁上；一些颗粒凝结在一起。
Charlesworth提出了计算柱流出物蒸发时间的公式：
（2）
其中：td为完全挥发的时间；ΔHv/M为摩尔挥发度（该值与达到1毫米汞柱蒸气压时的温度成正比）；ΔT为雾化气体与液体表面温度差；Kf为液滴周围气体薄层的热导率。
当温度上升到一定程度，被分析物（x）亦会同流动相（o）一道挥发，因此最佳的温度为tdo<td<tdx。为了减小颗粒在漂移管管壁上的沉淀，td的选择最好是比tdx略高一点。FL/Fg增大则会使颗粒间更易凝结。
⑶在可以忽略漂移管管壁上的沉淀或颗粒凝结在一起而改变平均直径的情况下，进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径与被分析物在洗脱液中的浓度C成比例：
(3)
其中ρa为被分析物的密度。
对于轴心式的雾化器，当被分析物浓度为1mg/L时，被分析物颗粒的大小处在米氏散射区域。根据米氏理论，散射光强I可以表示为：
(4)
其中k为常数；N是散射区域中颗粒的数目；随着d/λ的增加，y值从4.0（瑞利散射区域）减小到-2.2。当λ和N为常数，散射强度以dp（p<6）增加，因此从式(3)可以看出，散射强度以cq（q<2）增加。
⑷校正曲线和检测限
当被分析物在洗脱液中的浓度较低时，被分析物浓度值的对数与响应值的对数的校正曲线大致呈线性。检测限可以通过公式算出：
(5)
其中mLOD为检测限（g）；m为注入的被分析物的质量（g）；N/H为噪音与峰高之比；x为校正曲线的斜率。
之后，Meeren等[15]建立了一个计算机模拟的ELSD检测机理模型，其基本理论也是建立在米氏理论的基础上。他们把影响ELSD的响应的因素分成四组：载气气压，雾化器的设计，流动相的组成和流速都将影响到雾化过程；被分析物的浓度和密度等决定了进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径；被分析物的折射指数，光源发出的光的强度和波长，光电倍增管的位置等将影响到散射光强度；光电倍增管的灵敏度和入射光的强度决定了检测的效率，即反映为实验者所观测到的峰面积。
冯埃生等[16] 和Trathnigg等[17]考察了影响ELSD检测性能的基本因素，他们发现漂移管温度对基线水平和噪音的影响没有明显的规律性，温度过低流动相得不到充分挥发，使基线水平较高；温度过高则可能带来更大的噪音。气体流速增大，使响应值减小，故最佳气速是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值的最低气体。流动相中可以加入低于10mmol/L的挥发盐来调节所需的酸度。他们在实验中也发现，峰面积和峰高的自然对数分别与浓度的自然对数有较好的线性关系。
此外，还有不少实验者在用ELSD检测各种物质时，不同程度地研究了影响ELSD检测性能的基本因素，但其研究都不够系统，而且没有提出相应的理论。
4. ELSD在HPLC中的应用研究
ELSD在对类酯[18~23]、表面活性剂[24~27]、糖[28，29]、氨基酸[30，31]、 季铵盐[32，33]、高聚物[34~36]、甾体化合物[37~39]等物质的检测，以及药物分析方面[40~45]发挥着重要的作用。
归纳起来，这些物质往往具有如下的特点：1.物质本身不含生色团或吸光系数不大，使用UVD检测灵敏度很低。2.物质组分复杂，组分间极性差异较大，分离需要进行梯度洗脱，故RID几乎不适用，短波长UVD在梯度洗脱时常会发生基线漂移。使用ELSD检测，可以克服这些困难。对于不含生色团的物质，ELSD可以不经衍生，直接进行检测，从而避免了衍生带来的误差；ELSD在检测过程中，将流动相完全挥发，因此在梯度洗脱时，基线平稳。对不同物质，ELSD响应因子的变化比其他检测器（如紫外检测器）要小得多，在因缺乏标准品而无法做校正曲线的情况下，利用ELSD可以近似地提供不纯物的定量测定。HPLC/ELSD的色谱条件与LC/MS是一致的，在脱机情况下，使用HPLC/ELSD可以为LC/MS摸索色谱条件，节省使用昂贵的LC/MS系统的操作成本，而且可以方便地用LC/MS来分析检测出的不纯物，进行结构判定。
5. 结论
在以上的研究中，实验者都要对ELSD进行条件优化，即通过调节载气流速和漂移管的温度，使信噪比达到最大。
ELSD的响应不依赖于物质的光学性质，能检测挥发性低于流动相的样品。其检测灵敏度高，检测限已可达ng级；检测过程中，其基线稳定，能进行梯度洗脱。
许多实验都表明，ELSD的响应值与被测物浓度的关系曲线比较复杂，在较高浓度范围内，大致呈线性；而在低浓度范围内，则大致呈指数关系，即满足A=acb，且b值往往在1―2之间(与理论相符合)；另有少数实验表明，响应值与被测物浓度为二次函数关系，即Y=aX+bX2。
理论表明，ELSD的响应与被分析物的理化性质有一定关系，但这种关系并不大，某些实验也证明了这一点，从这个意义上来讲，ELSD不能被称为真正的质量检测器；由于被测物往往为同一类物质，其性质比较类似，因此许多实验者报道响应不依赖于被分析物的理化性质，理论与实际并不矛盾。
参考文献
