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Waters高效液相色谱系统操作规程

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  来源:21世纪精细化工网

    1.目的

  规范Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

  2.范围

  本规程适用于Waters高效液相色谱系统的使用和维护。

  3.职责

  质检室仪器分析员负责Waters高效液相色谱系统的日常使用和维护。

  4.系统组成

  本系统由Waters600E多溶剂输送系统(有梯度控制器的高压输液泵)、Waters在线脱气机、Rheodyne7725i手动进样阀、Waters2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成,另外还包括打印机、断电保护器和通风柜等辅助设备。

  5.程序

  5.1.准备

  5.1.1.使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相(应足够;流动相必须用0.45μm滤膜过滤)、样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),更换合适的色谱柱(柱进出口位置应与流动相流向一致)和定量环。

  5.1.2.通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

  5.2.开机和泵操作

  5.2.1.开机

  5.2.1.1.接通断电保护器的电源,依次打开断电保护器、脱气机、600E泵、2487检测器,待检测器自检结束显示测量状态时,打开打印机、电脑显示器、主机。

  5.2.1.2.打开Millennium32软件,按「Login...」,输入用户名和密码,按「OK」注册进入系统主界面。在Project档内选择所需的项目,右击『RunSamples』图标,选择色谱系统“600_2487”后打开QuickSet窗口。

  5.2.2.更换溶剂

  5.2.2.1.打开600E泵后,转动进口集合管阀手柄(以下简称手柄)至RUN位置;

  5.2.2.2.将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂,向右打开参照阀(断开柱和进样器);

  5.2.2.3.按[Direct]键使其显示直接控制屏幕,设流速为1ml/min(梯度配比阀在0ml/min时不工作);

  5.2.2.4.选择欲使用的某一溶剂通道,设其比例为100%,其它为0%;

  5.2.2.5.将输液管从原有溶剂瓶中取出,放入一干净的空瓶中;

  5.2.2.6.逆时钟转动手柄至DRAW位置,用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂;

  5.2.2.7.再将输液管放入新溶剂瓶内,继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止;

  5.2.2.8.转动手柄至RUN位置,将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。

  5.2.2.9.重复5.2.2.4.~5.2.2.8.直至所有即将使用的溶剂更换完毕。

  5.2.3.排气泡

  5.2.3.1.打开参照阀,换流动相为100%超纯水,设流速为10ml/min(注意:确认参照阀是打开的,否则可能损坏安装好的柱);

  5.2.3.2.转动进口集合管阀手柄至DRAW位置,用启动注射器抽出约10ml水;

  5.2.3.3.顺时钟转动手柄至INJ位置,缓慢用力使水通过泵头从参照阀出口管排出(注意不要将气泡注入泵中);

  5.2.3.4.按[Stopflow]屏幕键停泵,关上参照阀。

  5.2.3.5.如按以上方法不能排尽气泡,从柱入口处拆下泵出口管,用塑料管连接至塑料烧杯中,设流速为10ml/min,冲洗2~5min(或更长时间)后停泵,重新接上柱。

  5.3.平衡系统(分两种情况进行)

  5.3.1.等度模式

  5.3.1.1.每次以0.1ml/min的增量加大流速至1ml/min,以超纯水冲洗系统10min。

  5.3.1.2.检查管路连接、柱接口及泵头处是否漏液,如漏液应予以排除。

  5.3.1.3.观察泵控制屏幕上的压力值,压力波动应在平均值的5~10%以内。如超出此范围,可初步判断为柱前管路仍有气泡,重复5.2.3.下的步骤。

  5.3.1.4.压力波动平稳后,换检验方法规定的流动相比例冲洗系统。在检查基线稳定性前,让最少5~6倍柱体积的流动相通过系统。

  5.3.1.5.在QuickSet窗口下的InstrumentMethod档内选择所需的仪器方法,按「Monitor」(此后泵由软件控制),观察基线和压力变化。如果冲洗至基线漂移<10-3Au/min,噪声为10-4Au数量级,且压力平稳时,可认为系统已达到平衡状态,可以进样。5.3.1.6.按「Abort」图标(左上第五个),停止监视基线。

  5.3.2.梯度模式

  5.3.2.1.按检验方法规定的条件冲洗平衡系统,并注意压力波动变化和排气泡。

  5.3.2.2.在进样前运行1~2次空白梯度。

  5.4.进样

  5.4.1.在QuickSet窗口内左下部选〈Single〉标签,在SampleName档内填写试样名称;在Function档内选择试样类型(标准选“InjectStandards”;样品选“InjectSamples”);在MethodSet档内选择所需的方法组;在InjectionVolume档内输入进样体积;在RunTime档内输入记录时间。

  5.4.2.用针头滤器过滤试样溶液(注射液可不必过滤),用试样溶液清洗注射器,并排除气泡后抽取适量。

  5.4.2.1.如按部分装液法,用微量注射器定容进样时,进样量应不大于定量环体积的50%,并要求每次进样体积准确、相同;5.4.2.2.如按完全装液法,用定量环定容进样时,进样量应不小于定量环体积的3倍(5~10倍准确性更佳)。

  5.4.3.按〈Single〉标签内右边的进样(Inject)按钮,等待窗口底部状态档内显示“Waiting”后,方可进样。

  5.4.4.将进样阀手柄转动至Load位置,将注射器针完全插入进样阀入口中,平稳地注入试样溶液,除另有规定外,让注射器留在进样阀上,将进样阀手柄快速转动至Inject位置,系统将自动运行,采集数据并记录图谱。

  5.4.5.让进样阀手柄保持在Inject位置,到下次进样前1~2min切换回Load位置,将注射器从进样阀中拔出。

  5.4.6.先用水再用试样溶液清洗注射器后,按以上程序继续进样,直至完成。

  5.5.数据处理(外标法)和打印

  5.5.1.右击系统主界面下的『BrowseProject』图标,选择相应的项目,按「OK」进入Project窗口,选〈Channels〉标签。5.5.2.建立处理方法选择一个待积分的标准,右击后选“Review”进入Review窗口。按「ProcessingMethodWizard」图标(左边第一个)进入NewProcessingMethod向导窗口,按「OK」。

  5.5.2.1.划入一个感兴趣的最窄的峰,按「Next>」;

  5.5.2.2.划入一段包含噪声的基线,按「Next>」;

  5.5.2.3.划入一段要积分的区间,按「Next>」;

  5.5.2.4.根据情况选择最小峰面积和最小峰高,按「Next>」、「Next>」;

  5.5.2.5.在Name档内输入各组分峰的名称,按「Next>」、「Next>」;

  5.5.2.6.在MethodName档内填写方法名称,按「Finish」。退出Review窗口。

  5.5.3.修改标准选中所有标准,右击后选“AlterSample”进入AlterSample窗口。

  5.5.3.1.在SampleType档内将Unknown改成Standard;

  5.5.3.2.按「Amount」图标(左上第六个)进入ComponentEditor窗口;

  5.5.3.3.按「CopyfromProcessMethod」图标(左上第五个),选择刚建立的处理方法,按「Open」,在Value和Units档内分别输入标准所含各组分的数值和单位,完成后按「OK」回到AlterSample窗口;

  5.5.3.4.按「Save」图标存盘,退出AlterSample窗口。

  5.5.4.积分先选中所有标准,再选中所有未知样品,右击后选“Process”进入BackgroundProcessing&Reporting窗口,选Usespecifiedprocessingmethods,在右边档内选择刚建立的处理方法,按「OK」。

  5.5.5.打印在Project窗口下选〈Results〉标签。

  5.5.5.1.选中要打印的标准/样品,右击后选“Preview”进入OpenReportMethod窗口,选合适的打印方法,按「OK」进入ReportPublisher(Preview)窗口,预览打印的结果。按打印(Print)图标(左上第二个)即可打印结果。

  5.5.5.2.按「Close」可进入ReportPublisher窗口对报告方法进行修改,完成后按「Print」图标(右数第二个)即可打印结果。

  5.5.6.数据处理完成后,关闭所有窗口,在主界面下按「Logout」退出系统,关闭Millennium32软件,再依次关闭电脑主机、显示器、打印机。

  5.6.清洗系统和关机

  5.6.1.数据采集完毕后,关闭检测器,继续以工作流动相冲洗10min后,换水冲洗。

  5.6.2.清洗进样阀

  5.6.2.1.用启动注射器吸10ml超纯水;

  5.6.2.2.将注射针导入口冲洗头(Rheodyne部件号7125-054)连接到注射器出口上(不要针),并将它们一起接到进样口上;5.6.2.3.使进样阀保持在Inject位置,慢慢将水推入,水将通过注射针导入口、引导管、注射针导入管和注射针密封圈,由样品溢出管排出。

  5.6.3.清洗柱

  5.6.3.1.C18柱先用超纯水以1ml/min冲洗40min以上,再用甲醇或乙腈冲洗20min。

  5.6.3.2.ProteinPAK60柱先用超纯水冲洗90min以上,再用甲醇或乙腈冲洗40min。

  5.6.4.用水冲洗柱后,分别用20ml超纯水冲洗柱塞杆外部和法兰盘上小孔。

  5.6.5.清洗完成后,先将流速降到0,再依次关闭泵、脱气机、断电保护器,断开电源。

  5.6.6.填写使用记录。

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