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高效液相色谱实验技术问题解答

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1.高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的?

解:气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件,从它的高效、高速和高灵敏渡得到启发,采用四微粒出定相以提高柱效,采用高压泵加快液体流动相的流速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器,提高检测灵敏度,克服经典液相色谱曲缺点,从而达到高效、快速、灵敏。
2.与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些优点和不足
解:气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。因此它只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。而高效液相色谱由于以液体作为流动相,只要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度,便可以分析,所以适用性广,不受样品挥发性和热稳定性的限制,特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物,例如,生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。在目前已知的有机化台物中,只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离,80%的有机化合物要用高效液相色谱分析。
    气相色谱中流动相是惰性的,它对组分没有作用力,仅起运载作用、而高效液相色谱的流动相不仅起运载作用,而且流动相对组分有一定亲合力,可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性,另外可作流动相的化合物多,选择余地广。
    与气相色谱相比,高效液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易,只要开口容器放在柱子末端,就可以很容易地将所分离的各组分收集。回收是定量的,可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
    高效液相色谱不足的是,日前检测器的灵敏度不及气相色谱。必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。
3.试比较气相色谱与液相色谱的曲线,分析产生不同的原因。
    从图可看出,气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线,形状迥然不同,流动相的流速对柱效的影响也不一样,在气相色谱的H-u曲线上,塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一最低点,这时柱效最高,板高最小,流速最佳。而液相色谱H-u曲线,未出现流速降低板高增加的现象,由于最佳流速趋近于零,一般观察不到最低板高相对应的最佳流速。在正常的情况下,流速降低,板高H总是降低的,这与气相色谱明显不同。在气相色谱中流动相流速增大,柱效呈直线降低,而在液相色谱中,流动相流速增大,柱效平缓降低。其主要原因是液相色谱的流动相为液体,液相的扩散系数Dm很小,通常仅为气相扩散系数的10000~100000分之一,所以分子扩散项在低u时也不起多大作用、因此液相色谱H-u曲线未能出现流速降低,板高增加现象。到高速时,虽然柱内线速提高,但固定相和流动相的传质都能很快进行,故H-u曲线上升缓慢。
4.简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素,如何减少谙带扩张、提高柱效?
解:液相色谱中引起色诺峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。在液相色谱中要减小谱带扩张,提高柱效,要减少续料颗粒直径,减小境料孔穴深度,提高装填的均匀性,采用低粘度溶剂作流动相,流速尽可能低,同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。
5.为什么要提出折合参数有何特点?
解:我们知道色谱操作条件对板高是有影响的.Giddings发现,固定相相同,填充良好,共是粒度dp不同,因而H-u曲线不同,在液相色谱中,培板高度是粒度的函数,为了比较不向色谱条件下的板高H.提出折合参数,包括折合板高、折合流速、折合柱长。其特点是对于不同粒度的填料能得到相同的H-ur 曲线,因此可以在相同的条件下比较不同填料的柱效。
6.色谱柱A长度为15cm,载体粒度为5m.另一B柱长为30cm,载体粒度为10m,两柱的柱效相等吗?
解:A柱的折合柱长为30000,B柱的折合柱长也为30000,表明组分在两根柱内从柱人口到出口都经过30000个载体颗粒.两校的柱效相等。
7.何谓梯度淋洗,适用于哪些样品的分析?与程序升温有什么不同?
解:梯度淋洗就是在分离过程中.让流动相的组成、极性、pH值等按‘定程序连续变化。使样品中各组分能在最佳的k下出峰。使保留时间短、拥挤不堪、甚至重叠的组分,保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离,特别适合样品中组分的k值范围很宽的复杂样品的分析。梯度淋洗十分类似气相色谱的程序升温,两者的目的相同。不同的是程序升温是通过程序改变柱温。而液相色谱是通过改变流动相组成、极性、pH值来达到改变k的目的。
8.流动相为什么要预先脱气?常用的脱气方法有哪几种?
解:流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处,气泡进入检测器,引起光吸收成电信号的变化,基线突然跳动,干扰检测;溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时,可能与流动相或固定相发生化学反应;溶解气体还会引起某些样品的氧化降解.对分离和分析结果带来误差。因此,使用前必须进行脱气处理。常用的脱气法有以下几种:(1)加热脱气法;(2)抽吸脱气法;(3)吹氦脱气法;(4)超声波振荡脱气法。
9.按固定相孔径大小分类,液相色谱固定相有哪几类?各有什么特性及适用范围?
解:从固定相的孔隙深度考虑,液相色谱固定相分为表面多孔型(薄壳型)和全多孔型(全孔型)两类。
    表面多孔型固定相多孔层厚度小.孔浅,相对死体积小,出峰迅速,柱效高,颗粒较大,渗透性好,由于孔浅,梯度淋洗时,当流动相成分改变后.孔内外流动相成分能迅速达到平衡,机械强度高,装柱容易,其不足的是由于多孔层厚度小,因而柱容量小,最大允许样品量受到限制,适用于比较简单的样品分析及快速分析。
    全多孔型固定相,由于颗粒很细,孔仍然很浅.传质速度较快,柱效高。梯度淋洗时孔内外流动相成分的平衡速度仍然较快.其最大特点是柱容量大,最大允许样品量是表面多孔型的5倍,但装填的什于渗透性低,因而需要更高的操作压力.制柱比表面多孔型的难。这种固定相特别有利于痕量组分及多组分复杂混合物的分离分析。

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