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高效液相色谱法的优点和常见问题

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    高效液相色谱(High Pe-rformance Liauid Chromatography,HPLC)的主要优点是:⑴分辩率高于其它色谱法⑵速度快,十几分钟到几十分钟可完成;⑶重复性高;⑷高效相色谱柱可反复使用;(5) 自动化操作,分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别,高效液相色谱可分为四个基本类型,即液-固色谱、液-液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定:⑴氨基酸及其衍生物;⑵有机酸;⑶甾体化合物;⑷生物硷;⑸抗菌素;⑹糖类;⑺卟啉;⑻核酸及其降解产物;⑼蛋白质、酶和多肽;⑽脂类等。     高效液相色谱的常见问题有:
 1、涡流扩散(Eddy diffusion)
  流动相碰到较大的固体颗粒,就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀,有的部分松散或有细沟,则流动相的速度就快;有的部位结块或装直紧密则流就慢,多条流路有快有慢,就使区带变宽。因此,固相载体的颗粒要小而均匀,装柱要松紧均一,这样涡流扩散小,柱效率高。
 2、分子扩散(Molecular diffusion)
  分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动,也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时,如果流速太慢,被分离物质停留时间长,则扩散严重。
 3、质量转移(Mass transfer)
  被分离物质要在流动相与固定相中平衡,这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中,溶质分子要在两个液相之间进行分配,或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时,转移速度慢,来不及达到平衡动相就向前移,这各物质的非平衡移动,使区带变宽。
 4、动相流速
  当流速太低时,分子扩散严重,特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图,理论塔板高度随流速增加而急速下降,当达到最低值时,流速再加大则质量转移起主要作用,理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中,流速稍快影响不大,但在凝胶过滤色谱中,因为物质要渗透到凝胶内部,所以质量转移影响大,流速咖大会降低柱效率。
 5、固定相颗粒大小
  定相颗粒越小柱效率越高,对流动相流动的阻力越大,需要加大压力才能使它流动。

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