高效液相色谱法入门知识

　　高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。采用微柱液相色谱系统可以减少溶剂的消耗并达到快速分离之目的。

　　高效液相色谱法的主要分离机制有吸附、分配、离子交换和排阻作用。

　　1．对仪器的一般要求

　　所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。

　　（1）色谱柱

　　最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等因素）以及色谱柱的填充，将直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在150？以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在300？以上的填料。以硅胶为载体的键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。

　　（2）检测器

　　最常用的检测器为紫外吸收检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测物的质量有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物结构均有响应；蒸发光散射检测器属质量型检测器，对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱管制和色谱峰纯度的检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测物的质量呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测物的质量通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。不同的检测器，对流动相的要求不同。当采用紫外检测器时，所用流动相应至少符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。

　　（3）流动相

　　由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常不应低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

　　正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求，可在该品种项下注明。

　　2．系统适用性试验

　　色谱中最难分离物质对或与其相关的物质对的分离度和待测物响应值的重复性是系统适用性试验的重要参数。

　　按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应符合要求；或规定色谱条件下的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

　　（1）色谱柱的理论板数（n）

　　在规定的色谱的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2），按n＝5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的效果等），使理论板数符合要求。

　　（2）分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：

　　式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；

　　tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；

　　W1及W2为此相邻两峰的峰宽。

　　除另有规定外，分离度应大于1.5。

　　（3）重复性

　　取各品种项下的对照溶液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子。其相对标准偏差也应不大于2.0%。

　　（4）拖尾因子为保证测量精度，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：

　　式中W0.05h为0.05峰高处的峰宽；

　　d1为峰极大至峰前沿之间的距离。

　　除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。

　　3．测定法

　　定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但测定杂质含量时，须采用峰面积法。

　　（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量

　　按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

　　校正因子式中AS为内标物质的峰面积或峰高；

　　AR为对照品的峰面积或峰高；

　　CS为内标物质的浓度；

　　CR为对照品的浓度。

　　再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品（或其杂质）峰和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

　　含量式中AX为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；

　　CX为供试品（或其杂质）的浓度；

　　A′S为供试品溶液中内标物质的峰面积或峰高；

　　C′S为供试品溶液中内标物质的浓度；

　　f为校正因子。

　　当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，CS=C′S，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。

　　（2）外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量

　　按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：

　　含量式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。

　　（3）加校正因子的主成分自身对照法

　　测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种正文中。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪声水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液中的主成分色谱峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分（通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的RSD应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%）。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。

　　（4）不加校正因子的主成分自身对照法

　　当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。

　　（5）面积归一化法

　　由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量个杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。