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浅谈高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)

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    液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法,又因分析速度快而称为高速液相色谱法。也称现代液相色谱。

    HPLC鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多,因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

    一、液相色谱理论发展简况色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之得名。F后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法

    二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点:高压――压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。高速――流速为0.1~10.0ml/min。高效――可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种高灵敏度――紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:速度快――通常分析一个样品在15~30min,有些样品甚至在5min内即可完成分辨率高,选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高――紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg柱子可反复使用――用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少,容易回收――样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。

    三、色谱分离原理色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationaryphase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法高效液相色谱法按分离机制的不同分为:液固吸附色谱法液液分配色谱法(正相与反相)离子交换色谱法离子对色谱法分子排阻色谱法

    1.液固色谱法使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

    2.液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。正相色谱法采用极性固定相,流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。反相色谱法一般用非极性固定相,流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。

    3.离子交换色谱法固定相是离子交换树脂,缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

    4.离子对色谱法离子对色谱法常用ODS柱(即C18),流动相为甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10mmol/L的离子对试剂,在一定的pH值范围内进行分离。5.排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料,流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中,滞留时间长;大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出。

    四、实例应用

    高效液相色谱法测定面粉中荧光增白剂荧光增白剂是卫生部严令禁止在食品中添加的制癌性物质。对混在面粉、面粉改良剂、面粉快速发酵粉等和食品添加剂中的检验、国家有定性及限量方法,但操作复杂,耗时长,为此,我们建立了简便、快捷、灵敏度较好的高效液相色谱法。

    1.1 试剂:1荧光增白剂标准液33号0.1g,加水溶解,定容至100mL,(含荧光增白剂1.0mg/ml)2棕色瓶中保存使用时吸取上述标准溶液10mL,置于100mL容量瓶中,加水稀释至刻度(相当于0.1mg/ml荧光增白剂)3甲醇

    1.2 仪器条件:流动相100%甲醇,测定波长365nm;流速灵敏度1.0AUFS

    1.3 操作步骤提取:将样品粉碎,称取5.0-10.0g于具塞三角瓶中,加50ml水,电动振荡器振荡30分钟后,调节pH至中性,定容至100ml;,抽滤,弃去初滤液10ml,剩余滤液再经微孔膜(0.45μ)过滤,滤液待用。

    测定:分别取标准溶液及样品提取液注入高效液相色谱,进行色谱分析,根据保留时间及峰面积定性、定量。现代的色谱分析方法在分离效率、分离和分析有机结合操作过程的自动化方面作了很大的改进。其中包括气相色谱法和高效液相色谱法两大类,它们已成为分离分析工作中最重要的方法。

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