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HPLC系统:样品鉴定和分离的工具

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1967

    高效液相色谱法(HPLC)已经从早期的色谱技术发展成为一种具有许多专门用途的精调处理方法了。这种技术可以广泛地用于分离混合物样品中的溶质――这对于辨认混合物样品中的成分来说意义重大。例如,HPLC经常用于鉴定组织匀浆中出现的多肽的丰度。另外HPLC对少量样品来说也十分有用,因为这种技术十分灵敏,而且不会破坏样品,所以对于热不稳定样品来说比较安全。

  和其他类型的液相色谱一样,HPLC操作流程首先是将样品注入到装有小颗粒填料的色谱柱(固相色谱柱)中。色谱柱的长度一般为5-30cm(近期更多的倾向于小型化),内直径一般为1-9mm,内部填料颗粒的直径为3-10mm。样品在流动的液相中移动,液相可以根据样品和分离物的性质来选择不同的溶剂混合物。

  当液相流过柱子之后,样品中的每一种成份会被分别洗脱;液流检测器记录下每一种洗脱的成分,从而能够测量单个成分特有的保留时间。样品中与固相相互作用较强的成分具有较长的保留时间,并且洗脱较迟;而与固相相互作用较弱的成分则保留时间较短,在色谱柱内流动更快,洗脱较早。

  如果要选择HPLC系统,个人觉得必须首先了解你所需要的色谱柱的特性,这是由样品的性质决定的。目前有许多种色谱柱:利用离子交换、分子筛、生物亲和、和样品的手性等等。同时也要根据所需的色谱层析规模来选择合适的HPLC系统。总的来说,分析型色谱适合用于样品中成分的鉴定和定量,通常在皮克到毫克的水平;而制备型色谱的则适合于获得纯化的分离样品,通常在毫克到千克的水平。选择时同样也需要考虑选择一种合适的检测器,如紫外光,折射率、荧光和质谱检测器等。以下是根据Biocompare网站选择的目前市场上提供的HPLC系统的不同特点。

  色谱柱特性(Columncharacteristics)

  假如你想要寻找一个能分离复杂的混合物的色谱柱,Varian公司的新产品PursuitXRs也许对你就有很大的吸引力。该柱具有专门为特别高分离度的样品设计的,由大小为100埃的硅珠形成的巨大表面面积(surfacearea)。Varian公司宣称该柱子能够分离复杂的混合物。据报道,PursuitXRs寿命十分长,注射样品5000次后仍没有降解的迹象。PursuitXRs系列有C-18,C-8和二苯基(Diphenyl)固相等色谱柱。

  检测器和系统模块(Detectorsandsystemmodularity)

  Waters公司研制出了新一代HPLC系统――Alliance,该系统是基于他们的2695型分离模块(2695SeparationsModule)的基础上开发的,该分离模块能调节溶质和样品的分别管理。2695能与Waters公司的全部HPLC色谱柱兼容,包括:IntelligentSpeedIS,Symmetry,XBridge,和XTerra柱等;同样也与许多检测器兼容,包括质谱等。溶剂管理系统能去除系统中的气泡并且能根据所需的比例混合成4种溶剂,可以设定范围为每分钟50ul到5ml的流速程序。样品管理系统的特点还包括注入样品的体积的范围为1微升到数百微升,另外该系统还包括了五个独立的样品carousel,能够在运行一个样品的carousel的同时准备另外一个样品,大大的节约了时间。此外,Alliance系统还包括了一种色谱柱加热器或者加热器/冷却器来控制温度,并且当没人看管时,能对色谱柱转阀。除此之外Waters公司还提供了一种BreezeHPLC系统,包括了泵、检测器、注样器和软件在内。为了使该系统具有用户友好的界面,不同的HPLC类型都预安装了Breeze系统(Breeze系统适用于教学和分析应用)。

  Cecil仪器仪表公司则是以其模块HPLC系统为之自豪,该公司市场部的AdeKujore表示,他们能提供可以一系列检测器,如可变的UV/可见光波长检测器、双重波长的可变UV/可见光检测器、WaveQuest超快速扫描UV/可见光检测器、扫描荧光检测器、电导检测器、电化学检测器和折射率检测器等。Cecil公司的产品同时还具有其他的一些特性,如能提供手动或者自动上样操作;自动上样装置包括了全面的样品预处理和样品的温度控制两部分。此外,还具有样品的自动柱后衍生化、样品成分的收集和色谱柱温度调节容易进行等优点。

  Shimadzu(岛津)科学仪器公司也具有自己的模块HPLC产品。该公司的主要HPLC系统为Prominence系列。该公司的产品经理CurtisCampbell说,他们的HPLC产品的关键部分包含了SIL-20A自动进样器,可以进行最快的样品注射(10秒注射10uL)和防止样品过载――这正是Shimadzu公司为高通量HPLC提供的该产品的速度优势:将该子送样器的速度与Prominence系列泵的高分离度相结合,能给用户提供一种目前市场上最高通量的HPLC系统。利用Prominence系统和2.2um的ShimadzuXR新型色谱柱可以在循环时间为23秒内进行梯度分离样品。这种卓越的循环时间指标意味着Prominence系统在通量上能超过许多价格上更贵和提供更大压力的HPLC系统。

  此外,Shimadzu公司的CBM-20控制系统则被誉为首个基于web网的HPLC控制系统――可以直接与实验室的网络连接。它基于XML语言的界面使得用户能够远程设置、控制、监视和维护HPLC系统。该控制系统具有网络服务器,用户只要用IP地址连接就能监控HPLC仪器。同时该系统整合了安全和密码特性。

  分离规模

  各个公司提供了不同的HPLC分离规模的选择,Varian公司据称以其提供的制备型HPLC为傲。他们的PrepStar和SepTech系统就是两个例子。用户可以根据你样品的类型选用这两种形式,对于毫克到克数量级样品纯化来说,可以考虑他们的小颗粒填料的固相色谱柱(直径5-10um)高效系统;对于选择分离数千克的纯化样品的经济系统来说,可以考虑Varian公司的大颗粒填料作为固相(直径为10-25um)的高通量系统。

  Agilent公司可以提供覆盖任何分离规模、流速范围从每分钟1纳升到100ml的HPLC系统。假如需要,还可以在同一个系统中同时实现这些目的。他们的1200SeriesLC系统是基于他们最畅销的1100系列HPLC的基础上开发的,它的稳定性和机动性确实值得一提的。

  Agilent公司的1200SeriesRapidResolution新系统是专门为提高效率设计的,它的运行时间(runtimes)可以低至0.5分钟。同时它也可以运行传统的方法。对于复杂的样品,该公司提供了具有多泵和多检测器装置的多维系统。此外,Agilent1200SeriesHPLC-Chip/MS系统较适用于蛋白质组分析和小分子分析,与Agilent6000SeriesMS系统联用可以提供更强有力的工具。其HPLC-Chip利用微流体技术(microfluidicst)主要用于确保HPLC系统根据芯片来工作,与MS系统联用则成为一种便利和灵敏度高的LC/MS研究系统。

  和Agilent公司一样,Nanostream也开发了一种应用微流体技术的小型芯片HPLC,可以用于分析样品。该系统的好处包括只需小量的溶剂和样品、最小化样品损失和提高样品分析能力24倍等。Nanostream公司的将小型HPLC技术与他们的Briocartridge捆绑在一起(Briocartridge系统由24种小型的液相色谱柱组成,可以平行运行24个样品)。

  Nanostream公司还提供了多种长度的色谱柱。NanostreamCL系统是为高通量化学分析设计的,适用于样品的纯度、可溶性、和成分的稳定性的研究系统。该系统包括了一个为384孔板设计的8针上样器和为96孔板设计的6针上样器,利用24紫外光吸光检测器进行检测,还可以选用荧光检测器。该系统还包括了一个板改变系统,能处理5096孔板或者384孔板。另外NanostreamLD系统是为检测基于液相色谱基础的酶分析而设计的;NanostreamCX系统则适用于制备用于随后进行的质谱分析的色谱层析样品。

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