液相色谱的问题解决：方法开发，峰形不正，干扰峰

　　本期的“液相色谱问题解决”对读者提出的一系列问题给予了解答。尽管其中的一些问题具有特殊性，但其解决方法可被普遍采用。例如文中讨论的第一个问题是如何处理一种特殊化合物―苯二甲酸的方法，但此方法可用于含酸的任何样品的处理。

　　问题：我们开发了一种方法来检测食物样品中的苯二甲酸，此法是先对样品进行皂化处理，然后用反相离子对色谱法来分析。经皂化后，基体的酸性非常强。在所有分析方法中，是液相色谱（LC）法最好，还是离子交换色谱法更加适合呢？

　　解答：对于如苯二甲酸的酸性样品，离子对色谱法是可取的，离子交换色谱法也是可行的，但我选择了从一种较为传统的技术开始。通常我喜欢使方法简洁一些。方法越是简单，引出的问题也就越少。因此，我从反相色谱法开始研究，它使用低pH值的流动相。（如果你决定用离子对或离子交换色谱法，在本节的末尾部分我就这两种方法如何进行添加了一些论述。）

　　从15或25cm×4.6mm，5um的C-8或C-18色谱柱开始。我比较喜欢用新型的碱灭活硅烷作为柱填料，而不喜欢旧型的色谱柱，因为碱灭活硅烷对拖尾较不敏感，并且在较宽的pH范围内稳定。为了在离子抑制的环境下操作，流动相的pH值应低于酸的pKa1-1.5个pH单位。苯二甲酸的第一个pKa为2.9，则需要在pH=1.4-1.9的环境下操作。一般情况下，除非你知道色谱柱在什么环境下是稳定的，否则我们应该尽量避免在pH〈2的环境下操作。我从pH=2.0开始，用25mM的磷酸盐缓冲液作为流动相的水溶液部分，同时用乙腈或甲醇作为有机溶剂。在这些条件下，苯二甲酸未能充分离子化而得不到好的峰形，并且表现得像中性化合物。因为芳香烃的特性，所以用UV检测在255nm应该有可能。

　　我较喜欢用搜索梯度来准确本身的流动相强度，正如以前的“液相色谱的确问题解决”和参考文献2所述。用有选择地逐步处理作为方法开发，开始时用90%有机溶剂作为起点，然后有机溶剂含量逐渐下降10%，直到得到合理的保留时间为止。在样品注射前可调节其pH值，使之与流动相的pH值接近。

　　低pH值流动相中的离子抑制比在高pH值流动相中的有更多优点。低pH值时，苯二甲酸的离子化受到抑制，所以会表现得像中性分子而其保留时间可预测且得到可接受的峰形。低pH值也抑制固定相中硅醇基团的离子化，这有助于减少峰拖尾。所有的反相色谱柱在3〈pH〈7的范围内是稳定的，而较新型的色谱柱可在2〈pH〈8甚至更宽的范围内操作。

　　如果你想在高pH值下操作，你应该知道pH值大于8时柱填料中的碱性硅会溶解。有些色谱柱比其它色谱柱稳定一些，较高的pH值下，封尾的色谱柱比没有封尾的色谱柱更加稳定。在碱性条件下，当用有机缓冲液（如柠檬酸）替代无机缓冲液（如磷酸盐）时色谱柱的稳定性得到改善。一种选择是使用聚合物反相色谱柱。这些聚合物色谱柱对pH值不敏感，但它们趋向于产生比硅胶色谱柱较低的理论塔板数和较宽的峰。

　　你提议的离子交换色谱法是在高pH值分离的另一个可能。离子交换相附着在聚合物小球上，具有你寻找的pH值稳定性，但与相应的反相色谱柱比较，其理论塔板数较低。

　　峰变形

　　问题：上一部分就苯二甲酸开发分析方法时，我们发现了如果制备苯二甲酸标准溶液时用水代替甲醇则其峰形得到改善。是什么原因导致这样的结果呢？我们使用的流动相是20：80（V/V）的甲醇-5mM磷酸盐缓冲液，并加入10mM四戊铵溴化物作为离子对。

　　解答：这样的结果是由注射入太大量的过强的溶剂引致的。图1解析了这个问题。图1a所示是变形峰，是将30ul样品注射入流动相的结果，样品用乙腈溶解，而流动相是含乙腈18%的水溶液。图1b所示的是正常峰，是用流动相作为注射溶剂溶解相同的样品。如果样品用不同于流动相的溶剂溶解，当被注射入时，样品溶液与流动相混合，并被稀释。如果注射的溶液比流动相强度大，则样品像在较强溶剂中一样会立即移动，并且较快地通过色谱柱，正如图1a所示，其保留时间比较短。当注射入的溶液与流动相混合时，有些分子与流动相的混合比其它分子更快，则它们穿过色谱柱的速率将发生改变，则谱带发生变形。如图1a所示，峰变形现象对较早洗脱的峰影响较大。解决将注射溶液量减至最少的问题的关键是使稀释在瞬间发生或者用强度不大于流动相的溶剂来溶解样品。较弱的溶剂在色谱柱中将样品浓缩，因此得到的峰往往是比注射入较强溶剂时更窄。

　　因此作为一般规律，如果样品溶于比流动相强的溶剂，则注射体积应少于25ul。注射容积取决于注射溶剂与流动相之间到底存在多大的差异，此差异很容易凭经验判断――只是等体积地增加注射的量直到峰开始变形，然后返回两个单位就可以了。在读者的问题中，样品溶于甲醇，但甲醇比流动相强得多，所以他得到变形的较宽的峰。当他用水代替甲醇时，则样品溶液弱于流动相，峰形就得到了改善。在离子对色谱法中，总是用流动相作为样品溶剂以减少基线后移现象。

　　干扰峰

　　问题：在反相LC分离法中，怎样避免溶剂前置峰对分析峰产生的干扰呢？

　　解答：有些化合物不具保留性，在开始分离时就被洗脱下来，避免这些物质的干扰的最好的方法是增加待分析化合物的保留时间。通常如果保留因子（k）大于1，则其色谱法和分离效果都会比较好。利用溶剂前沿作为规则可估计出k的值。色谱图的第一个峰通常是溶剂前沿峰或杂质峰，此峰的洗脱时间为色谱柱的死时间（t0），此时间表示一个在色谱柱中不保留的化合物通过色谱柱的时间。紧跟着死时间出来的是与色谱柱作用很小，并且很难从溶剂前沿和其它化合物的杂质峰中分离开来的物质。为了获得k值大于1，被检测的化合物的保留时间必须是死时间[k=(tr-t0)/t0]的两倍以上。例如，图1b中9.03min处的峰，其k值大约为1。

　　你可以通过使用较弱的溶剂来增加保留时间。对于反相LC，弱溶剂一般是水或缓冲溶液。每改变溶液中的有机溶剂含量的10%，则保留时间大约变化3倍。为了获得期望的保留时间，你可以利用这个“3倍规则”来估计需要改变多少有机溶剂。

　　如何开始？

　　问题：就反相LC分离而言，我看了很多关于选择初始条件的文献，但总体来说觉得很混乱，C-8好还是C-18好呢？我需要一根长为15cm的色谱柱还是25cm的色谱柱呢？我应该用乙腈还是甲醇那一种作为有机溶剂呢？就初始条件的选择你能给我一些指引吗？

　　解答：让我们单独地分析每一个参数吧。首先，C-8好还是C-18好，又或者是其它固定相更好呢？就大多数的应用而言，你选择任何一种固定相都只有很少的差异。对于某些物质，C-18比C-8更具保留性，所以极性较小的样品选用C-8柱比较适合，同时，极性越强的物质在C-18柱中的保留性就越强。对大部分物质而言，这样选择色谱柱是正确的。填料物质的特性是一个更重要的选择。新型的、洁净的、碱性去活硅（B型）有利于新方法的开发。在我的经验中，这些固定相比旧型的固定相总是产生更好的峰形和更少的拖尾。我坚信，你为色谱柱付出多少就有多少收获--$200一根的色谱柱不可能给你$400一根的色谱柱的运行水平。当然例外是存在的，但对大部分情况而言，当你在方法的开发上花费了数千美元并在分析上花费了数万美元时，色谱柱的分离能力有可能很差吗？

　　色谱柱长度是另一个反复选择的内容。大部分微粒的分离需要8000-10000的塔板数，填充5um微粒的15cm长的色谱柱或含有3um微粒的7.5-10cm长的色谱柱对实际样品会产生这个塔板数。所以仅从塔板数来看，长为15或25cm的色谱柱都是合适的。我比较喜欢用15cm×4.6um，3.5-um的色谱柱，因为它们能在流速为2ml/min，同时柱压为2500psi的条件下操作。较长的25-cm的色谱柱对于相同的柱压要求较低的流速。较长的色谱柱产生大约3倍的通过时间，这是因为柱长和流速大约影响整个分析结果的30%。使用一根新型的7.5cm×4.6um，3.5-um的色谱柱是另一个选择。这些色谱柱在大约一半的时间内产生与15cm的色谱柱相近的塔板数。你必须使用较短的、小微粒色谱柱避免产生柱外带加宽现象。你也可以使用窄孔柱（1-2mmi.d.），但他们也对由柱外因子引起的带加宽非常敏感。

　　最后，有机溶剂也是经常选择的内容。溶剂应该与水完全混溶，与分析物及色谱柱均不起反应，粘度低，适用于所使用的检测器。最常用的三种溶剂是乙腈、甲醇和四氢呋喃。四氢呋喃是平时最坏的选择―操作时令人感觉不适，化学不稳定（放置一段时间后会形成过氧化物），平衡速度慢。甲醇是基本无毒的，并且对于检测波长高于220nm的物质是一个好的选择。然而，我的第一选择是乙腈，因为我的实验开发的许多方法都是需要在低波长检测的。

　　总而言之，我喜欢的初始条件是15cm×4.6mm，5um的C-8或C-18色谱柱，流速为2ml/min，乙腈-水或乙腈-缓冲溶液作为流动相。我也成功使用过7.5cm×4.6mm，3.5-um的色谱柱。这些色谱柱中的任何一根都会提供一个好的出发点，因为它们对于大部分的分离而言都提供了足够多的塔板数，能在较低波长下检测，并且移动速率快。说到这，我认为使用长为15或25cm的C-8或C-18色谱柱，选择乙腈或甲醇作为流动相，这里的任何一个组合都是非常可行的―这就是你的选择。

　　结论

　　为一个新方法选择初始条件，包括选择色谱柱、流动相和注射溶剂。虽然这些因素的许多组合都是可行的，但使用低pH值的流动相、反相色谱柱以及与流动相相似的注射溶剂，会给你开始的成功带来最大的可能。