血水草生物碱的HPLC分离

摘要:建立了内衬聚亚胺型C18反相高效液相柱分离血水草生物碱HPLC新方法。考察了梯度洗脱分离时，起始缓冲液组成及pH值对分离的影响。当用0.028mol/LK2HPO4（pH8.5）为起始洗脱液，线性梯度洗脱至100％甲醇时，血水草提取液中主要生物碱以及含量较少的生物碱可得到理想分离。用峰面积归一化法考察不同地点，不同季节血水草各生物碱含量的变化规律，为血水草的采收提供了科学依据。
关键词　血水草,生物碱,高效液相色谱法
Abstract A new reverse - phase HPLC method for the separation of quaternary alkaloids in Eomecon chionantha Hance is described. A C18 column with silica - based packing pre - shielded with polyimide is employed. The effects of initial buffer composition and pH on the gradient elution have been investigated. The major alkaloids can be separated from minor constituents under a linear gradient elution mode. The initial eluate is 0.028 mol/L K2HPO4 at pH 8.5, whereas the final eluate is 100％ methanol. It is found that the contents of alkaloids in the herb from different places are different, and vary with growing seasons too.
Keywords Eomecon chionantha Hance, Alkaloid, HPLC
　  血水草系罂粟科白屈菜属植物，包含多种季胺型生物碱，如血根碱、白屈菜红碱、普洛托品碱及别隐品碱等。对该属植物生物碱曾尝试过用纸层析法[1]、薄层层析法[2]、离子对色谱法[3]等分离分析，但分离中或多或少存在着一些问题，难以获得准确的定性定量结果。毛细管等速电泳[4]和高效液相色谱法[5]为该类生物碱的分析提供了快速准确的手段，但用HPLC分离时仍存在线性响应太差、峰拖尾、洗脱液组成复杂等问题[5]。优化生物碱的HPLC分离条件仍是值得探讨的课题。本工作用自己研制的内衬聚亚胺型反相高效液相色谱柱[6]考察了血水草生物碱的分离。
1　实验部分
1.1 仪器
　　Waters 991型HPLC仪，包括2台Waters 510型高压泵，U6K进样阀，Waters自动梯度控制仪，Waters 991型光电二极管阵列检测器，Waters 5200绘图仪以及色谱工作站（美国Waters公司）。
1.2 试剂
　　乙腈（色谱试剂）、甲醇、NaH2PO4、Na2HPO4、NH4Ac、（NH4）2SO4均为AR级。血根碱(San)、白屈菜红碱(Che)、普洛托品碱(Pro)及别隐品碱(All)等生物碱标样由湖南省中医学院提供。实验洗脱用水为蒸馏水经离子交换柱处理，用millipore超纯水装置处理，减压过滤后备用。
1.3 血水草生物碱提取液的制备
　　用95％( )乙醇浸泡血水草，过滤后用盐酸沉淀生物碱。将沉淀分散于水中，用碳酸钠溶液调节水溶液至约pH9，用氯仿提取生物碱。蒸去氯仿后，用乙醇溶解固体物质制备样品。
1.4 内衬聚亚胺型C18反相高效液相色谱固定相的制备
　　氯丙基硅烷键合相依次和三乙烯四胺、环氧氯丙烷交替反应后，再与十八碳酰氯反应制得本工作用内衬聚亚胺型C18反相高效液相色谱固定相。
2　结果与讨论
2.1 分离条件的选择
　　用商品C18柱分离生物碱，需考虑生物碱出峰与否、峰形对称性，以及定量分析的可信度等。优化分离需采用复杂的分离体系，并常因酸性硅羟基的非特异性吸附作用，分离十分困难。我们研制的新型硅基C18固定相已被证明是分离含氮碱性化合物理想的色谱填料[6]。
2.1.1 有机洗脱溶剂对分离的影响采用0.028mol/L(NH4)2HPO4(pH7.5)为起始缓冲液，20min线性梯度分别洗脱至100％( )甲醇和100％( )乙腈，并维持终止条件5min，得到血水草4种主要生物碱：别隐品碱、普洛托品碱、白屈菜红碱及血根碱的分离色谱图(图1)(略)。两种条件下，峰型均有同样的对称性，而用甲醇－水作洗脱液时，血根碱和白屈菜红碱具有更大的峰面积;因此选择廉价的甲醇－水替代乙腈－水，既能降低分离成本，又可获得理想分离。
2.1.2 pH值对分离的影响pH值对非季铵型生物碱的分离有显著影响，pH值太低，生物碱以季铵离子形式存在，在C18柱上保留较弱，别隐品碱和普洛托品碱不能有效分离。当起始缓冲液pH值上升到7.5时，二者分离明显改善，分辨率Rs>1.5;继续升高起始缓冲液pH值，影响不明显。pH值对季铵型生物碱如白屈菜红碱及血根碱的分离影响不大。
2.1.3 缓冲液浓度对分离的影响分别用Na2HPO4配制的0.028mol/L、0.1mol/L、0.25mol/L缓冲液作为起始缓冲液，以上述的梯度洗脱方式，考察不同浓度缓冲液对分离的影响(表1)。缓冲液盐浓度增大,血水草中难分离物质对血根碱与白屈菜红碱的分离度Rs无明显改善。盐浓度太大对分离的负面影响增加，以普洛托品碱为例，柱效降低，峰不对称因子随盐浓度增大而变小，由对称的高斯峰变为前伸峰，可解释为缓冲液的盐抑制效应对峰形不利。
表1 起始缓冲液浓度对分离的影响
Table 1 Influence of initial buffer concentration on the separation

2.2 工作曲线的制作
　　生物碱的定量分离难题之一是其线性相关性差[5]。以图1a的分离条件，制作工作曲线。对血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱、普洛托品碱的混合溶液,进样100μL,80μL,60μL,40μL,
20μL,10μL和5μL各一次，测定峰面积，用线性回归法求其回归方程，各生物碱线性相关性良好，结果见表2。
表2 生物碱的线性关系
Table 2 Linearity of the alkaloids

2.3 血水草的分析
　　采用0.028mol/L(NH4)2HPO4(pH8.5)为起始缓冲液，20min线性梯度分别洗脱至100％( )甲醇，并维持终止条件5min，血水草的分离见图3(略)。各生物碱色谱峰峰型对称，柱效高，有利于量少的生物碱的分离分析。
对不同季节采自高海拔山林地带的血水草和采自阳光充裕低海拔开阔地带的血水草用面积归一化法，考察生物碱相对含量的变化，结果见表3。
表3 血水草生物碱相对含量的测定
Table 3 Analysis of alkaloids from Eomecon chionantha Hance Relative content/％

　  高海拔山林地带血水草中别隐品碱、普洛托品碱相对含量受季节影响较小;低海拔开阔地带4种生物碱样品变化较为明显。
3　结论
　　（1）血水草生物碱在聚亚胺反相高效液相色谱柱可得到理想的分离。
　　（2）pH值对分离影响显著，pH值为7.5时分离较理想。
　　（3）起始缓冲液浓度对分离度影响不大，盐浓度大于0.03mol/L时，柱效下降，峰形变为不对称。
作者简介： 左雄军, 男， 34岁， 副研究员
作者单位：中国科学院广州化学研究所 广州 510650
参 考 文 献
1 Grabaczyk H, Gertig H. Spectrophotometric determination of chelidonine and other alkaloids in celandine(Chelidonium majus L).Chemia Analit, 1976, 12(3): 505
2 冯瑞芝，连文芝，傅桂香，肖培根. 罂粟科白屈菜族的化学分类及资源利用.植物分类学学报， 1985，23（1）：36
3 Dazido T. Modification of retention of some alkaloids in the system silanized silica. J Chromatogr, 1988, 439(2): 257
4 Walterova D, Preininger V, Simainek V. Qualitative and quantitative isotachophoretic analysis of some quaternary isoquinoline alka-loids. Planata Med, 1984, 50(2): 149
5 Niu Changqun, He Liyi. Determination of isoquinoline alkaloids in Chelidonium majus L.by ion pair high - performance liquid chro-matography. J Chromatogr, 1991, 542(1): 193
6 左雄军，徐友志，徐秉坤.固定化有机改进剂RPHPLC固定相的研究.分析测试技术与仪器,1995, 1(4): 32