饲料中越霉素A的TLC鉴别方法的研究

    摘要：用80％乙醇溶液浸提饲料中的越霉素A，浓缩后分别用薄层色谱法对6种展开剂、3种薄层板类型和3种显色剂进行了筛选。研究结果表明，用8O％乙醇溶液提取越霉素A、以氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2为展开剂、在碱性硅胶G薄层板上展开、用0.25%茚三酮乙醇溶液显色，能将越霉素A与其他活性成分在薄层板上分离，越霉素A的Rf值为0.47。该法的最低检测浓度为0.04 mg／ml，最低检出限为0.2μg。该方法简单，易操作。
    关键词：饲料；越霉素A；薄层色谱法 ．
    越霉素A(destomycin A，简称DM．A)是1965年由近藤氏从链霉菌(Streptomyces rimofaciens)的培养液中提取的一种碱性氨基糖苷类抗生素，它与越霉素B、越霉素C相差1个甲基，与潮霉素B分子式相同，只存在立体结构差异。
    DM．A抗菌作用广谱，对细菌、真菌及植物的病原性霉菌等均有较强的抑制作用，能防治各种白粉病。对猪蛔虫、猪鞭虫、肠结节虫、类圆线虫及鸡盲肠虫、绦虫、毛细线虫也有较好的驱虫效果。
    DM．A的鉴别方法，国内外研究较少。我国《进口兽药质量标准》(农牧发[1999]2号)中用薄层色谱法对其进行鉴别，固定相为硅胶G，甲醇-氨水(1：2)为展开剂，展开后用茚三酮试液显色(但在该条件下，笔者未能得到DM．A斑点)。日本曾将薄层层析法(TIC)与生物自显影法联用，对DM．A进行定性或定量，但精密度和精确度都不高。为建立一种新的鉴别DM．A 的定性方法，以快速、简便地确定饲料中是否含有DM．A，为严格控制抗生素在饲料中的滥用提供理论依据，特作如下研究。
    1 材料与方法
    1．1 材料
    湖北省饲料检测站抽样样品另加4O×0.000001浓度的DM．A。
    1．2 主要药品及仪器
    硅胶G：青岛海洋化工有限公司制造(CP)。DM．A标准品：中国兽医药品监察所提供。0.25%茚三酮溶液：0.25 g茚三酮溶于100 ml95%乙醇中，避光保存。0.1%蒽酮溶液：0.1g蒽酮溶于100ml浓硫酸中，现配现用。邻苯二甲醛溶液：0.2 g邻苯二甲醛溶于4O ml pHl0乙醇中加2-巯基乙醇0.4 mlpHl0乙醇：5Oμl 45%NaOH水溶液加到195 ml95%乙醇中制得。
    1．3 方法
    1)薄层板制备。分别用蒸馏水(A板)、pH7.0磷酸盐缓冲液(B板)、pH9.0磷酸盐缓冲液(C板)以2.8：1(溶剂：硅胶)的比例调制薄层板，将制好的薄层板在展开剂Ⅵ中预展至顶端，取出，晾干，活化后置干燥器中备用。
    2)标准品和样品的制备、点样。标准品原液：准确称取DM．A标准品0.025 g至5 ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，配制成浓度为5mg／ml的标准原液待用，最好现配现用，放置时间不能超过2周。
取全价饲料100g用500ml 80%乙醇溶剂溶解(饲料重量和溶剂体积比为1：5)，振荡30min，取全部上清液于蒸发皿中，在78℃的水浴锅上蒸干，用2ml的蒸馏水少量多次地将提取物洗至10ml的离心管中，用5 ml三氯甲烷重复洗涤，然后3000r／min离心10min，取水相点样，每次5μl。
    如果是预混料，则取20g样品溶于100ml 80%乙醇溶液，用液体快速混合机混合10min，在3000r／min条件下离心10min，取上清液，重复3次，合并上清液以后步骤同全价饲料处理过程。
    3)展开剂的筛选。在配制好的薄层板上分别点样：A不含DM．A的空白样品5μl、B含DM．A的样品5μl、C样品2.5 μl+标准品2.5μl、D含杂标准品(标准品原液放置1月后)5μl、E标准品(现配)5μl，在I～Ⅵ号展开剂中展开，用0.25 茚三酮的乙醇溶液显色，记录各个斑点的Rf值和相邻斑点的分离度R。Rf=斑点中心至点样圆点的距离／展开剂前沿至圆点距离，R-相邻两斑点距离／该两斑点直径的平均值。
    展开剂如下：I甲醇：氨水=2：1、Ⅱ氯仿：甲醇：氨水=1：1：1、Ⅲ氯仿：甲醇：氨水=1：2：1、IV氯仿：甲醇：氨水=1：2.5：1、V 氯仿：甲醇：氨水=5：12：6、Vl氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2。
    4)显色剂的筛选试验。用pH9.0磷酸缓冲液：硅胶G=2.8：1的比例调制薄层板，活化后，点样，在Ⅵ号展开剂中展开，分别用0.25%的茚三酮乙醇溶液、0.1%蒽酮硫酸溶液、邻苯二甲醛溶液显色，观察显色效果。
    5)最低检测限的测定。分别取0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg／ml的DM．A标准品5μl在pH9.0磷酸缓冲液调制的薄层板上，用Ⅵ号展开剂展开，茚三酮显色，观察试验结果。
    2 结果与分析
    2．1 展开剂筛选和薄层板吸附类型的研究展开后记录各处理的各斑点的Rf和相邻两点之间的R值。可见：CⅥ组和AⅣ组效果较好，但AⅣ组中DM．A 的比移值太小(Rf=0.15)，所以选用薄层板C、Ⅵ号展开剂。
    2．2 显色剂的筛选
    分别用0.25%茚三酮、0.1%蒽酮溶液、邻苯二甲醛溶液3种显色剂，在相同条件处理的薄层板上显色。
    2．3 最低检测限的测定
将配制好的标准原液逐步稀释，稀释至浓度为0.04 mg／ml时，点样5μl，能见DM．A的斑点，稀释至0.02mg／ml时，斑点模糊，继续稀释未见斑点，可见DM．A的薄层TLC方法的最低检测限为0.04mg／ml，最低检测量为0.2 μg。
    3 讨论
    3．1 薄层板吸附类型
    根据结果，建议DM．A的鉴别采用pH9.0磷酸盐缓冲液配制硅胶G薄层板，以展开剂Ⅵ(氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2)展开，可以得到较好的薄层层析图谱，DM．A与其他活性物质均能得到较好的分离。
    何丽一认为：硅胶G为弱酸性，在分离某些碱性化合物时斑点拖尾，为改善拖尾可在硅胶中加入碱或用碱性缓冲液制成碱性薄层板分离生物碱或碱性化合物时，可改善分离。本试验中DM．A是氨基糖苷类抗生素，呈弱碱性，用pH9.0的磷酸缓冲液配制薄层板，效果比用pH7.0磷酸盐缓冲液好，说明偏碱性的DM．A在碱性薄层板中能得到
较好的效果，结果与该文献相符。
    3．2 显色剂筛选
    DM．A是一类氨基糖苷类抗生素，含有3个氨基，可分别用氨基和糖苷的显色反应对其进行显色。可以比较3种显色剂的优劣，从检测灵敏度来看，邻苯二甲醛显色剂占优势，但该试剂较昂贵，且显色需要仪器条件，蒽酮溶液显色灵敏度不高，且溶液稳定性、安全性差，茚三酮溶液配制简便，省去了吡啶试剂(一般氨基糖苷抗生素显色用)。既节约成本，又利于环保，显色结果稳定，所以可作为DM．A的鉴别显色试剂。
    3．3 DM．A的稳定性
    该试验过程中，由于标准品原液放置过久(约1个月后)在薄层上分离出2个斑点，而现配的标准品在薄层板上只1个点，可能是因为DM．A在放置过程中有一小部分转化成了其它物质的缘故，但由于时间和条件限制，本试验未对其进行鉴定，有待以后进一步研究。
    4 结 论
    饲料中的DM．A可用薄层色谱法进行鉴别：经80%乙醇浸提饲料样品中的DM．A，用碱性pH9.0的磷酸盐缓冲液配置薄层板(硅胶G ：溶剂=1：2.8)，氯仿：甲醇：氨水：水=1：4：2：2展开，0.25 茚三酮乙醇溶液显色。在此条件下，DM. A和其它活性成分以及氨基酸分离良好。
参考文献
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3 李美同主编．饲料添加剂．北京：北京大学出版社，1998．94～95
4 张乔主编．饲料添加剂大全．北京：北京工业大学出版社，1994．179～180
5 何丽一编著．平面色谱方法及应用．北京：化学工业出版社，2000.16