超临界二氧化碳萃取工艺对蛇床子素提取率的影响研究

　　摘要：对五因素间的交互作用进行考察，确定超临界CO2萃取的最佳工艺参数。方法采用二次回归连贯设计的方法。结果P萃与T分Ⅰ之间的交互作用较为明显，T分Ⅰ与T分Ⅱ之间的交互作用次之，T萃与T分Ⅰ、T萃与P分Ⅰ，P分Ⅰ与T分Ⅱ之间的交互作用对蛇床子素提取率有一定影响。优化的工艺条件为：萃取压力为40 MPa，萃取温度40℃；分离Ⅰ温度45℃；分离Ⅱ压力为5 MPa，分离Ⅱ温度为46℃；CO2流量为18 L/h，萃取时间为80 min，在此条件下，蛇床子素提取率可达4.32%。结论采用二次回归连贯设计可以客观地反应各因素对目标函数的影响规律。

　　关键词：超临界二氧化碳萃取； 蛇床子素； 提取率； 二次回归连贯设计

　　蛇床子系伞形科蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri(L.) Cuss.的干燥成熟果实。中药蛇床子的化学成分比较复杂，除挥发油外，主要为蛇床子总香豆素（Total coumarins of Fructus Cnidii ,TCFC）。TCFC主要以蛇床子素（osthol）和欧前胡素（inperatorin）为主，目前已知的蛇床子提取物的化学成分可达40多种。蛇床子味辛苦，性温，具有散寒、祛风、杀虫等功能。用于湿痹腰痛、阴痒带下等。有关蛇床子的超临界CO2萃取工艺，日本学者宫地洋［1］对台湾产蛇床子进行过初步研究，以中国大陆部分产地的蛇床子为研究对象，广州市医药工业研究所的葛发欢等对其挥发性成分［2］和有效成分的萃取［3］进行过初探，山西省中医研究院的王永辉等［4］进行了萃取压力、萃取时间及CO2流量三因素对蛇床子素含量影响的研究。然而，影响超临界CO2萃取的工艺参数较多，且工艺参数间往往存在交互作用，为此，本文针对超临界CO2萃取全过程采用二次回归连贯设计法对五因素及其交互作用进行研究，确定了各因素及其交互作用对蛇床子素提取率的影响规律，从而得出回归方程，由此得出最佳工艺参数。

　　1 材料与仪器

　　材料：蛇床子购自江苏省姜堰市药材公司，经山西省中医学院中药鉴定室裴香萍、牛燕珍老师鉴定系伞形科蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri(L.) Cuss的干燥成熟果实。将蛇床子粉碎至120目备用。CO2：太原天计应用化工有限公司生产，食品级，纯度在99%以上。蛇床子素的标准品购于中国药品生物制品检定所。实验装置：HA1215001C型超临界萃取装置（采用一萃二分流程），由江苏省南通华安超临界萃取有限公司制造。DF20型流水式中药粉碎机，由无锡中银机械制造有限公司制造。LC5500型高效液相色谱仪，UV检测器, 由北京市东西电子科技研究所制造。ME2.1型超声波清洗器，由美国Metter Electronics公司制造。

　　2 实验过程

　　2.1 超临界CO2萃取基本流程如下：CO2瓶→制冷系统→高压泵→萃取釜→分离釜Ⅰ→分离釜Ⅱ→（循环）。实验过程：称取120目蛇床子粉末200 g放入萃取釜中，对萃取釜、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ、贮罐分别进行加热或冷却，当达到所选定的温度时开启CO2瓶，通过高压泵对系统进行加压，当系统压力达到所设定的压力时，开始循环萃取，保持恒温恒压，按照计算机设定的取料时间间隔为每10 min取1次料，从分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ出料口中取料。

　　2.2 蛇床子素含量的测定

　　2.2.1 色谱分离条件色谱柱为ODS（十八烷基硅烷）柱；流动相为甲醇水（8∶2）；流速为1 ml/min；检测波长为322 nm;柱温为35℃，进样量20 μl。在上述色谱分离条件下，用外标法测定蛇床子素的含量。

　　2.2.2 线性关系考察 蛇床子素对照品采用归一化法对其纯度进行测定，结果为98%。精密称取蛇床子素对照品0.031 2 g，用95%乙醇溶解并定容至100 ml，得0.312 mg/ml的蛇床子素对照品溶液。分别量取上述蛇床子素对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml置于6个25 ml容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，待测。根据浓度(X)-峰面积（Y）进行线性回归，回归方程：Y=2 747.47+1.550×107X，r=0.999 86 ，线性范围6.24~37.44 μg。

　　2.2.3 方法精密度实验精密称取蛇床子提取物5份，按本实验方法分别测定蛇床子素的含量，RSD为1.49%，表明方法精密度良好。

　　2.2.4 加标回收率实验精密称取已知含量的蛇床子提取物样品，分别加入一定量的蛇床子素标准品，按本实验方法进行测定。结果：回收率为99.09%~101.86%.

　　2.2.5 样品测定样品的前处理：用第1溶剂（石油醚：醋酸乙酯=85∶15）100 ml润柱（柱子为100 ml酸式滴定管，硅胶为粗孔80～100目），取1.0 g蛇床子超临界CO2提取物，用5 ml醋酸乙酯溶解后，倒入润洗好的柱子内，再用第1溶剂120 ml润洗，最后用100 ml95%乙醇洗脱，收集样品，将溶剂挥干后待测。样品的测定：精密称取经过处理的蛇床子超临界CO2提取物0.02 g至25 ml容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，再取2.5 ml稀释至25 ml容量瓶中，定容至刻度，待测。

　　2.3 蛇床子素提取率的计算

　　蛇床子素的 提取率（%）=蛇床子提取物的质量×提取物中蛇床子素的含量 药材的质量×100%

　　3 实验设计方案

　　由于蛇床子素提取率受萃取釜、两个分离釜工艺条件的影响，我们选择萃取压力、萃取温度、分离Ⅰ压力、分离Ⅰ温度、分离Ⅱ温度这五个因素,并依据经验确定分离Ⅱ的压力为5MPa，CO2流量为18L/h，通过多次实验确定萃取时间为80 min。本实验最开始采用一次回归正交设计，但由实验结果所得出的回归方程经检验： F回=S回/V回 SR/VR=10.56F0.05(15，4)=5.86，表明方程的置信度有95% Flf=Slf/Vlf Se/Ve=4.50F0.25(1，3)=2.02，表明方程是失拟的。因此必须增加实验次数加大误差自由度并对各因素间的非线性关系进行考察。采用L16(215)表进行二次回归连贯设计［5］，设：萃取压力（z1）、萃取温度（z2）、分离Ⅰ压力（z3）、分离Ⅰ温度（z4）、分离Ⅱ温度（z5），各因素编码值如表1。采用该法后，为简化计算，按文献［5］的要求，对各影响因素进行重新编码。

　　表1 因素编码（略）

　　Δj。r为待定参数，r=1.719(计算方法详见4.1中) 。z0j(0)代表零水平实验点；z2j(+1)，z1j(-1)代表一次回归正交设计中各因素的最大值点和最小值点，z12j (+r)，z11j (-r)代表二次回归连贯设计（即一次回归正交设计中的最大值点1和最小值点-1均扩大r倍）中各因素的最大值点和最小值点。

　　4 结果与讨论

　　4.1 结果实验结果见表2。总的实验次数N=mc+mr+m0, m0为零水平重复实验次数（27～30号实验）， mc=1 2×2p正交实验次数（1～16号实验），mr=2p为考察非线性关系实验次数（17～26号实验），p为因素个数。对xj2列进行中心化处理［5,6］，即对表2中xj2列的第i次实验的因素编码（xij2）进行线性变换：xij1=xij2-1 NN i=1 xij2,其中 N i=1 xij2=mc+2r2=16+5.908=21.908， r2=Nmc-mc 2=2.954，r为待定参数。所以，xij1=xij2-0.730。表2中x1～x5列中的1，1，r，-r，0分别代表表1中各因素在z2j（+1），z1j（1），z2j 1(+r)，z11j (r)，z0j (0)时所对应的数值。x1x2～x4x5列中的数值为每个因素分别取1，1，r，r，0值时相应的乘积。x11 ～x15 列表示将各因素分别取1，1，r,r,0时代入到xij2线性变换式中所得的值。

　　表2 实验设计方案与结果（略）

　　表中yi为蛇床子素的提取率

　　4.2 方差分析与试验结果讨论根据表2的实验结果，作方差分析。

　　Se=Σm0 i0=1yi02-1 m0(Σm0 i0=1yi0)2=0.020,ve=m0-1=3,F0.01(1,3)=34.12,F0.05(1,3)=10.13,F0.1(1,3)=5.54,F0.25(1,3)=2.02；式中Dj (x0除外)，x1~x5中的Dj=16+2r2，x1x2~x4x5中的Dj 为正交实验次数(16)，x1′~ x5′中的Dj =2r4，r=1.719,x0中的Dj 为总体实验次数：Bj=ΣN i=1Xijyi,bj=Bj Dj ,Sj =bjBj,Fj=Sj/Vj Se/Ve由表3可知：在实验研究范围内，对蛇床子素提取率影响较为显著的是萃取压力（z1）与分离Ⅰ温度（z4）的交互作用；次为显著的是：分离Ⅱ温度(z5)、分离Ⅰ温度（z4）与分离Ⅱ温度(z5)的交互作用、萃取压力（z1）；有一定影响的是：萃取温度（z2）与分离Ⅰ温度（z4）的交互作用、萃取温度（z2）与分离Ⅰ压力（z3）的交互作用、分离Ⅰ压力（z3）与分离Ⅱ温度（z5）的交互作用。回归方程：蛇床子素的提取率（%）=3.70+0.10x1-0.042x2+0.058x3+0.12x5+0.055x1x2-0.05x1x3-0.20x1x4-0.095x2x3+0.096x2x4-0.041x2x5+0.041x3x4-0.091x3x5-0.13x4x5-0.046x2′-0.077x3′-0.043x4′+0.050x5′ （1）将表1中的各因素编码公式及xj2列中心化处理公式代入方程（1）中，整理得回归方程，如下：蛇床子素的提取率（%）=-7.13+0.102 5×z1+0.034 55×z2+0.344 2×z3+0.187 6×z4+0.043×z5+0.000 55×z1z2-0.001×z1z3-0.002×z1z4 -0.001 9×z2z3+0.000 96×z2z4-0.001 025×z2z5+0.000 82×z3z4-0.004 55×z3z5-0.003 25×z4z5-0.000 46×z22-0.003 08×z32-0.000 43×z42+0.003 125×z52 （2）做回归方程(2)的显著性检验， F回=S回/V回 SR/VR=11.80F0.01(20，9)=4.80，表明回归方程置信度是99%， Flf=Slf/Vlf Se/Ve=1.75F0.25(6，3)=2.42表明方程拟合得很好,可认为是最优回归方程。综合考虑各因素之间的影响及交互作用，得到优化的工艺条件为：萃取压力40MPa，萃取温度40℃；分离Ⅰ压力10MPa，分离Ⅰ温度45℃；分离Ⅱ温度46℃。代入到回归方程中可得：蛇床子素提取率的Y值为4.42%。为了更直观地表述各因素及其交互作用对目标函数的影响规律，我们将其中的三个因素固定为最佳值，在实验研究范围内根据回归方程考察其它两个因素，得图2～11。从图中曲线不难看出，在实验研究范围内蛇床子素的提取率随z2、z4的增加而递减（个别特殊的情形除外）；随z1、z5的增加而递增；从图中可以看出z3对目标函数的影响较为复杂，无一定的规律可循；除z1与z2、z1与z5、z3与z4外各因素间均存在显著的交互作用。根据超临界CO2萃取的原理，z1、z3通过改变CO2 流体密度改变物质在其中的溶解度（压力增加溶解度增加）；z2、z4、z5则通过改变CO2流体的密度和物质的蒸气压而改变物质的溶解度（温度升高，CO2流体密度降低；物质的蒸气压增大。前者使物质的溶解度减少，后者使之增加）。各因素对目标函数的综合影响趋势最终取决于哪一方占主导优势。但溶质自身的性质是影响超临界CO2流体溶解能力最主要的因素。由于蛇床子素的提取率取决于蛇床子提取物的质量和提取物中蛇床子素的含量这两个方面。因此，图中反映的规律应当是温度和压力对蛇床子提取物的质量和提取物中蛇床子素的含量这两个方面综合影响的体现。

　　采用超临界CO2萃取蛇床子中的蛇床子素等生物活性组分，当分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ的压力相同时，均从分离釜Ⅰ中出料，而分离釜Ⅱ中无收集物。保持分离釜Ⅱ的压力为5MPa，在一定范围内变化分离釜Ⅰ的压力时，大约90%以上的提取物仍然从分离釜Ⅰ中出料。从实验结果看，第1个10 min内提取物的出料量约占总出料量的50%，以后出料量随时间的延长逐渐减少。

　　4.3 回归方程的预测范围在上述优化的工艺条件下，Y值的预测区间可以利用3σ［5］规则来确定。因为σ=0.42,所以，在优化的工艺条件下，其指标真值在4.42±0.42之间，即4.00到4.84之间，此时置信度为99%。4.4 验证实验依照最优的工艺条件，进行验证实验见表4。结果与回归方程预测结果基本接近，表明该工艺稳定可行。

　　参考文献：

　　［1］ 宫地洋，山本秀树.超临界萃取生药成分的研究［J］.药学杂志（日），1987,107（5）：367.

　　［2］ 王海波，葛发欢，李 菁，等. 超临界CO2萃取蛇床子挥发性成分的研究［J］.中药材，1996,19（2）：84.

　　［3］ 葛发欢，李 菁，黄晓芬，等. 超临界CO2萃取蛇床子有效成分的工艺研究［J］.中药材，2001,24（8）：570.

　　［4］ 王永辉，张 荣，李艳彦，等.蛇床子超临界萃取工艺的正交设计试验研究［J］.山西中医，2005，21（3）：51.

　　［5］ 任露泉.试验优化技术，第1版［M］.北京：机械工业出版社，1987：121，243.

　　［6］ 上海师范数学大学数学系概率统计教研组编.回归分析及其试验设计，第1版［M］.上海：上海教育出版社，1978：162.