真空溶剂蒸发全二维液相色谱接口及其应用

　　【摘要】 以正相色谱(NPLC)为第一维, 反相色谱(RPLC)为第二维, 建立了真空溶剂蒸发接口的全二维液相色谱系统(VEI�C2DLC)。样品首先在第一维(CN色谱柱)进行正相分离, 第一维洗脱产物被交替存储到十通阀上的两个定量环中, 与此同时对切割到定量环内的第一维组分进行在线真空蒸发, 被分析样品组分保留在定量环内壁内, 而溶剂被蒸发除去。十通阀切换后保留在该定量环内的样品组分被洗脱到第二维进行反相分离，如此反复循环使第一维组分完全转移到第二维。采用标准样品和天然植物蛇床子提取液对该全二维液相系统进行了评价。

　　【关键词】  全二维液相色谱, 正相色谱/反相色谱联用, 真空溶剂蒸发接口, 蛇床子

　　1  引言
   
　　发展二维甚至多维色谱以满足复杂样品的分离需求, 是当前色谱领域的一大研究热点。目前商品化仪器已经实现了二维液相色谱系统，在复杂实际样品分析中应用得越来越广泛。 发展具有高峰容量、高选择性、分离速度快及可完全自动化的在线全二维液相色谱是二维色谱发展的主流。为了实现这一目标, 在液相仪器、 液相填料、分离速度、自动控制和数据处理软件等方面都需要有长足的发展。当然, 也需要有新技术、新方法不断地引入到二维色谱这一领域[1～5]。
   
　　正相色谱与反相色谱由于在保留机理上不同[6], 采用正相色谱与反相色谱联用在理论上应该得到具有高正交度、高选择性以及高峰容量的二维液相色谱。早在20世纪80年代, 就有文献[7]报道了正相色谱与反相色谱的在线联用。但是由于当时色谱分离速度的限制, 分离过程中采用了切割技术, 没有实现全二维正相色谱�反相色谱的联用。
   
　　随后的研究表明[8], 正相色谱与反相色谱的在线联用要实现理论上的高选择性和高峰容量, 应克服３个困难：（１）首先要解决两维流动相不相溶而导致第一维馏分切到第二维后谱带异常展宽和歧变问题；（２）由于第一维正相流动相为非极性溶剂, 在反相分离中洗脱强度大, 必然造成第一维样品组分在第二维柱头的扩散, 使进样谱带展宽, 柱效严重损失；（３）从第一维切割出的馏分体积往往远大于第二维的最大允许进样体积。
   
　　为了解决上述３个问题，本研究设计了一个真空溶剂蒸发接口(VEI)。该接口采用一个标准十通切换阀和一个真空泵, 对切割到定量环内的第一维正相流动相进行在线真空蒸发, 使被分析样品组分保留在定量环内壁内, 而溶剂被蒸发除去，采用该接口建立了在线全二维液相系统(VEI�C2DLC)。该系统充分发挥了正相色谱与反相色谱的各自分离特点, 实现了两维的组合优势。

　　2  实验部分

　　2.1  试剂和仪器
   
　　乙腈、甲醇(色谱纯, Merck)；正己烷、正丙醇和二氯甲烷(色谱纯, Fluka)。配制的流动相均经过0.45 μm微孔滤膜过滤。菲（分析纯，沈阳联邦试剂厂)、邻二硝基苯(CMBH & CO, Germany)、对甲氧基苯甲醛标样(Sigma公司)；异欧前胡素(中国药品生物制品检定所)；蛇床子(大连美罗大药房)。其它试剂均为分析纯。实验用水为“娃哈哈”纯净水(娃哈哈集团, 杭州)。
   
　　一维分离采用毛细管液相色谱仪(Micro�Tech Scientific Inc, USA)进行等度洗脱；P230高压恒流泵(大连依利特分析仪器有限公司)进行第二维洗脱。一维检测采用检测器1, CE�1575 UV/VIS Detector (Jasco, Japan)；检测器2, UV�VIS LC�830可变波长检测器( Soma Optics, Japan)进行第二维检测。DL�0型真空计由北京大学电子系生产, 2XZ�2型旋片真空泵(极限真空0.06 Pa, 抽速2 L/s, 上海真空泵厂制造)。

　　2.2  样品制备
   
　　蛇床子正己烷提取液的制备：称取干燥蛇床子药材5.0 g, 加入40 mL正己烷浸润3 h, 水浴温度66 ℃回流6 h, 然后改回流装置为蒸馏装置, 在水浴温度76 ℃时蒸馏出部分正己烷。母液冷却后3000 r/min离心15 min, 取上清液过滤, 放置冰箱中备用。
 
　　图1  VEI�C2DLC系统连接示意图（略）

　　Fig.1  Schematic diagram of comprehensive two�dimensional liquid chromatographic system with vacuum�evaporation interface(VEI�C2DLC)   

　　2.3  VEI�C2DLC分离系统的构建
   
　　采用VEI接口, 构建了全二维液相分离系统(VEI�C2DLC), 如图1所示。当一维洗脱产物被切割到十通阀的定量环1中时，真空泵对定量环1抽真空(定量环外缠绕的加热电阻丝保证定量环内温度一直维持在25 ℃), 正相溶剂在高真空状态下迅速蒸发为气体被真空泵抽走, 而被分析组分沉积在定量环内壁。此时Pump 2 的流动相经定量环2到反相柱然后进入检测器。当十通阀切换后, 第一维洗脱组分被切割到定量环2中, 此时真空泵对定量环2进行抽真空, 使第一维溶剂蒸发。与此同时, Pump 2 流动相将定量环1中的第一维样品组分洗脱进入反相柱进行分离检测。如此反复操作, 使第一维洗脱组分交替转移到两个定量环中进行在线真空蒸发, 然后依次被洗脱进入第二维进行反相分离。

　　3  结果与讨论

　　3.1  VEI�C2DLC系统分离标准样品
   
　　第一维馏分的溶剂在定量环内被蒸发后可以实现两维溶剂的转换,  但是第一维流动相必须是以气体形式被真空抽走, 如果是以液体形式抽走则必然造成大部分样品的丢失。因此, 必须有充分的理论依据可以证实在接口处第一维流动相可以蒸发成气体。通过兰式化学手册(第十五版)[9], 可以计算出几种常用流动相在室温(25 ℃)时的蒸汽压, 从而在理论上证实了在常温条件下正己烷等正相流动相可以蒸发为气体。

　　图2  一维正相色谱分离标样的色谱图（略）

　　Fig.2  Chromatogram of standards separated by one�dimensional normal phase LC

　　分析柱(separation column)：160 mm×0.53 mm i.d.(CN, 5 μm)；等度洗脱(isocratic  elution)：dichloromethane/1�propanol/hexane (5/5/90，V/V)；流速(flow rate)：10 μL/min； 进样量(injection volume)：0.5 μL；检测波长(wavelength)：250 nm。1. 菲(phenanthrene)；2. 茴香醛 (anisaldehyde)；3. 异欧前胡素(imperatorin); 4.邻二硝基苯(o�dinitrobenzene).
   
　　本研究采用了４种不同沸点化合物考察该真空蒸发全二维系统的分离效能，以便全面地评价该接口的特点。图2为4种化合物的第一维正相色谱分离谱图，第一维按照几种化合物的极性不同进行分离，非极性的菲最先洗脱，强极性的邻二硝基苯被最后洗脱。而当第一维组分被转移到第二维后又按照样品组分的疏水性差异进行第二次分离，两维的分离机理完全不同，提供了高正交度的全二维液相色谱条件。
  
　　图3A和3B分别为采用VEI�C2DLC和分离条件相同但未采用真空蒸发技术的常规全二维液相色谱（C2DLC）分离4种不同沸点化合物的第二维谱图。比较分离结果可见，在采用C2DLC系统时, 由于第一维组分在第二维的谱带展宽, 第二维的谱峰宽度都要大于VEI�C2DLC系统的分离结果。另一方面, 在采用VEI接口时由于切割到第二维的组分中第一维溶剂量很小, 切割组分被富集到第二维的柱头, 而当后面的组分被洗脱到第二维柱头时, 由于极性强于前面被富集的组分, 因此反而先于前面的组分被洗脱出第二维色谱柱（见谱峰2与1, 以及谱峰4与3）。这进一步证实了本研究所设计的VEI接口可以成功地使第一维流动相在线蒸发。
   
　　图3  VEI�C2DLC系统 (Ａ)和 C2DLC系统（Ｂ）的全二维系统分离标样的谱图（略）

　　Fig．3  Ｃhromatograms of standard mixture separated by two�dimensional liquid chromatographic(2DLC) system VEI�C2DLC (A) and C2DLC (B)

　　1st�D. 分析柱(separation column)：160 mm×0.53 mm i.d.(CN, 5 μm)；等度洗脱(isocratic  elution)：dichloromethane/1�propanol/hexane (5/5/90, V/V)；流速(flow rate)：10 μL/min； 进样量(injection volume)： 0.5 μL。 2nd�D． 50 mm×4.6 mm i.d. (RP�18e，monolithic column)；梯度洗脱(gradient  elution)：A�H2O, B�methanol, 2.5 mL/min；检测波长(wavelength)： 265 nm；采样时间(sampling time)：1.5 min; 定量环(sample loops)：15 μL。(A) 真空度(vacuum degree)：90～100 Pa; (B) without solvent vacuum�evaporation. The peaks were the same as in Fig.2。

　　表1提供了该4种化合物的绝对回收率（标样VEI�C2DLC分离的峰面积与一维反相色谱直接进样相对应的峰面积比）。从表１可以看出, 样品回收率与沸点基本呈线性关系。对于难挥发化合物, 样品回收率在50%以上; 而对于半挥发性化合物, 沸点越低回收率也越低, 其中茴香醛在几种样品里的回收率最低, 这主要是由于茴香醛属于挥发油类, 沸点低挥发程度高, 在真空条件下也有部分蒸发。虽然在本实验所采用的真空条件下，被分析物都未达到沸点，但是在真空条件下都具有一定的挥发度；另一方面，在两维界面处残余的反相流动相也会带走部分样品，从而造成了采用VEI�C2DLC分离样品的绝对回收率比较低的原因。

　　表1  不同沸点化合物采用VEI�C2DLC色谱分离的样品回收率（略）

　　Table 1  Recoveries of standards separated by the VEI�C2DLC system

　　3.2  实际样品分离

　　3.2.1  第一维流动相的优化  为了加速第一维流动相的在线真空蒸发速度，在以前的实验中[1]，第一维的流动相只采用正己烷。由于正己烷是非极性, 分离选择性较低, 在分离复杂样品时需要1 h甚至更长的分离时间。因而总的二维分离时间较长, 不适合快速分离。因此在本实验中, 考察了第一维采用混合流动相进行VEI�C2DLC分离蛇床子正己烷提取液（见图4）。结果表明，在正己烷中加入极性有机溶剂后，不仅可以加快第一维的分离速度，调整第一维分离的选择性, 而且对溶剂蒸发不会造成显著的影响。 

　　图4  蛇床子提取液采用混合流动相的一维正相分离谱图（略）

　　Fig.4  Ｃhromatogram of Cnidium monnieri (L.) Cuss. extract separated by one�dimensional normal phase liquid chromatography (NPLC) with 5% dichloromethane/5% 1�propanol/hexane as mobile phase

　　分析柱(separation column)：220 mm×0.53 mm i.d.(CN, 5 μm)；流动相(mobile phase)：dichloromethane/1�propanol/hexane (5/5/90, V/V)；流速(flow rate)：8 μL/min； 进样量(injection volume)：0.32 μL；检测波长(wavelength)：240 nm。

　　3.2.2  VEI�C2DLC系统分离蛇床子提取液  将所设计的VEI�C2DLC系统应用于蛇床子提取液的分离(见图5A), 可以在25 min以内将所有组分分离，分离速度快，主要的组分都得到了很好的分离, 谱峰尖锐, 具有很高的分离效率。
   
　　蛇床子提取液主要成分为挥发油以及香豆素类化合物, 其中挥发油类化合物沸点较低, 在真空条件下可以部分蒸发, 而香豆素类化合物的沸点相对较高, 在室温真空条件下挥发度较低。图5B为蛇床子提取液采用C2DLC分离所获得的色谱图。将该分离结果与VEI�C2DLC分离结果相比较，可以看到在VEI�C2DLC系统中主要组分都得到了很好的保留, 而一些挥发性组分在真空条件下回收率较低。

　　4  结论
   
　　建立了VEI�C2DLC（NPLC×RPLC）系统。该系统充分发挥了正相色谱与反相色谱的分离优势, 构成了正交度高的在线全二维液相系统。在线VEI接口解决了正相色谱与反相色谱流动相不互溶的问题；另一方面通过采用该接口技术，大幅度减少了第一维切割馏分进入第二维柱头的体积, 解决了正相色谱与反相色谱联用时第一维切割组分在转移到第二维柱头时体积过大和谱峰扩散现象。该系统具有分离速度快、分离效能高、两维分离的保留相关性低、每一维单独优化条件而互不干扰的特点。该系统可以采用商品化仪器搭建, 接口操作简单, 可以实现快速的自动化分析。

　　图5  全二维系统分离蛇床子正己烷提取液的色谱图(A) VEI�C2DLC系统 (B) C2DLC系统（略）

　　Fig．5  Ｃhromatograms of 2DLC system separation of Cnidium monnieri (L.) Cuss. Extract VEI�C2DLC system(A) and C2DLC system(B)

　　1st�D. 分析柱(separation column)：160 mm ×0.53 mm i.d.(CN, 5 μm)；等度洗脱(isocratic  elution)：dichloromethane/1�propanol/hexane (5/5/90, V/V)；流速（flow rate)：8 μL/min； 进样量(injection volume)：0.4 μL。 2nd�D． 50 mm×4.6 mm i. d. (RP�18e，monolithic column)；梯度洗脱(gradient  elution)：A�H2O, B� acetonitrile，60%～90% B in 26 minutes， 4 mL/min；检测波长(wavelength)：265 nm；采样时间(sampling time)：1.5 min; 定量环(sample loops)：12 μL。(A)真空度(vacuum degree)：80～90 Pa；(B) without solvent vacuum�evaporation。

【参考文献】
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　　3 Schoenmakers P J, Vivó�Truyols G, Decrop W M C. J. Chromatogr. A, 2006, 1120: 282～290

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　　9 Moore W J. in “Physical Chemistry” Fifth Edition, Longman, Lowe & Brydone. Ltd., London. 1972： 154